实验一附录_植物转基因载体的介绍
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水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导(以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织)1.消毒:取水稻成熟种子,人工或者机械脱壳,挑选饱满光洁无菌斑的种子,按以下步骤消毒:1)将种子放入100ml无菌三角瓶中,倒入70%酒精消毒1分钟;2)倒去酒精,加入100ml 3 %次氯酸钠(NaClO)溶液(次氯酸钠:水(V/V)=9:21),放入摇床振荡60分钟;3) 倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍,最后一遍浸泡30分钟。
2.诱导与继代培养:(以下步骤需无菌操作)1)种子放在无菌滤纸上吸干,置成熟胚于诱导培养基中,每皿10颗;2)操作完毕用封口膜封好培养皿,在26℃培养箱,(光)暗培养10-15天;3)在超净工作台上打开培养皿,用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织(淡黄色,致密呈球状),在26℃光(暗)培养箱,继代培养2周(继代两次)。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天,次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒,接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖(115度灭菌30min)。
乙酰丁香酮(AS)浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌(工程菌)培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基,在26-28℃,150 r/min振荡培养16-18 h,活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天,用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株,28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基,28 ℃振荡培养3~4 h。
分光光度计测定菌液浓度,并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1)将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中,加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟,期间摇动数次;2)倒去菌液,将愈伤组织取出,置于无菌的滤纸上吸干表面菌液(30-40分钟);3)将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。
微生物和动物细胞转基因开展较早,技术也比较成熟,相对动物和微生物转基因来说,植物转基因开展较晚。
自1984年获得第一株转基因烟草以来,近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。
下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。
原理根据植物细胞能再生成植株的全能性,利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中,通过组织培养获得完整植株。
在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选,最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。
以技术为媒介,一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。
外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。
受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同,可以选择外植体,愈伤组织,原生质体等。
一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力,并且能接受外源基因的整合,并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。
植物转基因流程图如下所示。
外植体)愈伤组织瞬时表达外源基因植物受体细胞原生质体生殖细胞稳定表达获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定(PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等)技术就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统:载体转化技术,直接转化技术和种质转化技术。
下面分别叙述。
一载体转化技术载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒,植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。
其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。
病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。
土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。
它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti(tumour-induced)质粒。
第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。
2. 熟悉转基因操作流程,包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。
3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。
二、实验原理拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种广泛应用的植物模式生物,具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点,使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。
转基因技术是将外源基因导入植物基因组中,使其在植物细胞中表达,从而改变植物性状或赋予其新的功能。
本实验采用农杆菌介导的转基因方法,将目的基因导入拟南芥基因组中。
实验流程包括以下步骤:1. 目的基因的克隆:从基因库或基因组DNA中提取目的基因,通过PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体构建:将目的基因克隆到载体上,如T载体或pBI121载体。
3. 农杆菌转化:将重组载体与农杆菌共培养,使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 植物再生:将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上,筛选出含有目的基因的转基因植株。
5. 鉴定:通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株(Col-0)2. 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆:根据目的基因的序列设计引物,进行PCR扩增。
将扩增产物与T载体连接,转化E. coli JM109感受态细胞,筛选阳性克隆。
2. 载体构建:将目的基因克隆到pBI121载体上,进行酶切和连接反应。
将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞,筛选阳性克隆。
3. 农杆菌转化:将重组载体与农杆菌共培养,使农杆菌感染拟南芥叶片。
将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上,筛选出含有目的基因的转基因植株。
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化(E. coli & 农杆菌)第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录:第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中,加入液氮研磨(电钻)。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液,迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ,颠倒混匀,-20℃冰浴30min 后,10,000rpm 离心5min ,将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注:若溶液中仍有植物组织,可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇(700 μl ),-20℃冰浴30min ,11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清,加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中,55℃水浴溶解1h ,再室温放置1d 。
实验准备:溶液配制:SDS-抽提液:1M Tris-HCl :100ml 5M NaCl :100ml 0.5M EDTA :100ml 10% SDS :125mlTE (pH8.0):1M Tris-HCl (pH8.0):5ml 0.5M EDTA (pH8.0):1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下,用干净刀片将所需回收的DNA条带切下,尽力切除不含DNA的凝胶,得到凝胶体积越小越好。
第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。
2. 学习拟南芥转基因方法,包括农杆菌介导转化和基因枪法。
3. 鉴定转基因植株,并分析其遗传稳定性。
二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株(野生型、突变型)2. 农杆菌菌株(如Agrobacterium tumefaciens C58)3. 转基因载体(含目的基因、抗生素抗性基因)4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆:根据目的基因序列设计引物,从基因库中克隆目的基因,并进行测序验证。
2. 构建转基因载体:将目的基因克隆到载体上,并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。
3. 农杆菌转化:将转基因载体转化农杆菌,制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选:将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株,筛选出转基因植株。
5. PCR检测:提取转基因植株DNA,进行PCR扩增,检测目的基因是否成功插入。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析:通过自交、回交等手段,分析转基因植株的遗传稳定性。
四、实验结果与分析1. 目的基因克隆:成功克隆目的基因,并进行测序验证。
2. 构建转基因载体:成功构建转基因载体,并插入抗生素抗性基因。
3. 农杆菌转化:成功转化农杆菌,制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选:通过喷洒或浸泡转化介质,成功筛选出转基因植株。
5. PCR检测:提取转基因植株DNA,进行PCR扩增,成功检测到目的基因。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析:通过自交、回交等手段,分析转基因植株的遗传稳定性,结果表明转基因植株遗传稳定性良好。
五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法,具有操作简便、转化效率高等优点。
2. 在转基因过程中,抗生素抗性基因作为筛选标记,可以有效筛选出转基因植株。
3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段,可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。
4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节,有助于确保转基因植物的安全性。
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术检测转基因烟草植株中目标基因的整合和表达情况,验证转基因植株的遗传稳定性,为后续的转基因烟草的研究和应用提供科学依据。
二、实验材料1. 转基因烟草植株:含有目标基因的烟草再生植株。
2. 实验试剂:DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、连接酶、T载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒等。
3. 实验仪器:PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪、显微镜等。
三、实验方法1. DNA提取- 将转基因烟草植株的叶片剪成小块,使用DNA提取试剂盒提取总DNA。
2. PCR扩增- 设计特异性引物,针对目标基因进行PCR扩增。
- 将提取的DNA作为模板,进行PCR扩增。
3. 电泳检测- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察扩增条带。
4. 测序验证- 对扩增的特异性条带进行测序,验证其序列与目标基因的一致性。
5. Southern blot检测- 使用限制性内切酶酶切转基因烟草植株DNA和野生型烟草DNA。
- 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。
- 显影后观察杂交信号。
6. Northern blot检测- 提取转基因烟草植株RNA,进行反转录PCR,扩增目标基因mRNA。
- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,转移至硝酸纤维素膜上。
- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。
- 显影后观察杂交信号。
四、实验结果1. PCR扩增- 转基因烟草植株DNA的PCR产物在预期位置出现特异性条带,而野生型烟草DNA没有扩增产物。
2. 测序验证- 测序结果显示,扩增产物序列与目标基因序列一致。
3. Southern blot检测- 转基因烟草植株DNA的酶切产物与探针杂交后,在预期位置出现杂交信号,而野生型烟草DNA没有杂交信号。
4. Northern blot检测- 转基因烟草植株RNA的RT-PCR产物与探针杂交后,在预期位置出现杂交信号,而野生型烟草RNA没有杂交信号。
农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理;掌握农杆菌介导转化植物的实验方法,了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的丁-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。
实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器:高压灭菌锅,超净工作台2、药品:Beef extract (牛肉浸膏)5g/L,Yeast extract (酵母提取物)1g/L, Peptone (蛋白胨)5g/L,Sucrose (蔗糖)5g/L,100ml,Agar (琼脂)100ml, MS粉,有机溶液,肌醇,Fe盐,NAA (萘乙酸),6-BA(6-苄氨基腺嘌吟),卡那霉素(kan),利福平("「,链霉素(str)。
二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基:先称取Beef extract (牛肉浸膏);Peptone (蛋白胨);Yeast extract (酵母提取物);Sucrose (蔗糖);1g ;琼脂粉;将上述药品置于250ml三角瓶中,用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀,然后再定容至250ml,用NaOH调pH=。
2、灭菌:将盛有250ml培养基的三角瓶封口,在三角瓶表面写清培养基名称,用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入:高压灭菌后,待培养基温度降到50-60℃时(手可触摸)加入已经过滤好的抗生素(100ug/ml kan+50Dg/ml Str+50ug/ml rif),以免温度过高导致抗生素失效。