植物表达载体构建

高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体摘要在植物基因功能分析中广泛使用的双链RNA干扰（RNAi），是一种高效率的系统，对于制作发夹RNA（hpRNA）结构有一个很大的需求量。

在这里，我们描述了一种新的限制性连接方法，提供了包含内含子的hpRNA（ihpRNA）载体的一种简单而高效的建设。

该系统以优势型IIS的限制性内切酶BsaI和我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG（GG）以GG克隆为基础。

这种方法需要有感兴趣的基因的BsaI 识别序列侧翼只有一个单一的PCR产物，然后可以克隆到pRNAi-GG 上在正方向和反方向同时形成ihpRNA的构造。

在这个过程中，在一个管与一个限制性连接步骤完成后，产生的重组ihpRNA具有高效率和零背景。

我们证明与pRNAi-GG载体向量生成的ihpRNA结构的效用有效沉默各种单独的内源和外源标志物基因以及同时沉默这两个基因。

此方法提供了植物功能基因组学的大规模分析的新颖的和高效率的平台。

介绍在双链RNA被发现作为一体的能触发RNA干扰（RNAi）之后[1]，RNA干扰也成为一个基因功能[2-4]分析的最强大的工具。

发夹RNA（hpRNA）结构通常用于通过RNA干扰[5]的机制来诱导靶基因的degra-dation。

在植物中，含有发夹RNA的内含子（ihpRNA）配有一个内含子作为间隔序列表示出了最高基因沉默效率[6]。

因此，ihpRNA结构已被广泛用于植物中的基因沉默。

与在植物中基因序列的爆炸性释放和基因组序列，高效率和成本制作ihpRNA结构系统需求量很大。

为了便于ihpRNA结构的产生，几种方法已经被报道。

传统的连接酶的载体如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA结构[6]。

该方法需要几轮限制和连接，并且因此，比较乏味和耗时。

有一种可替代地方法，GATEWAY 克隆系统为基础的RNAi载体如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被广泛用于产生ihpRNA结构[7-9]。

甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体的构建摘要：将甘蓝型油菜（Brassica napus L.）MYB4基因家族共保守的467 bp 反义片段构建到中间载体pCambia2301G中，替换GUS基因，由CaMV35S启动子驱动，形成了反义植物表达载体，命名为pCambia2301G-MYB4A，并转化到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中形成工程菌株，为进一步研究甘蓝型油菜MYB4基因家族的功能奠定基础。

关键词：甘蓝型油菜（Brassica napus L.）；苯丙烷代谢途径；MYB4基因甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物之一。

甘蓝型油菜中与苯丙烷代谢途径相关的农艺性状是研究人员长期致力于遗传改良的焦点。

经常发生的倒伏问题要求更加强壮的茎和分枝，抗病性的提高要求更高水平的受病原菌入侵而诱导的细胞壁木质化[1-3]。

另外，油菜种皮栅状细胞层中的色素主要与种皮中类黄酮类物质紧密相关，种皮中类黄酮类物质积累越多，种皮的颜色就越深，积累越少或没有时种皮就呈黄色，即呈现种胚的颜色，从而表现出黄子性状的优质特性[4，5]。

AtMYB4属于拟南芥R2R3-MYB家族的一种新的负调控转录因子，对于植株中抗紫外线类的芥子酸酯类物质的合成具有重要调控作用，该基因在大多数的植物组织中均有表达。

研究发现拟南芥AtMYB4基因突变体叶片中芥子酸酯的含量升高，并呈现出比野生型更强的紫外线耐受能力。

已报道AtMYB4转录因子调控苯丙烷代谢途径关键酶基因C4H的表达[6-8]。

因此，研究MYB4基因有利于阐明甘蓝型油菜苯丙烷类物质合成和相关性状形成的分子机理。

本研究通过构建甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体，为研究MYB4基因家族功能，阐明油菜木质素、种皮色素、花青素、植保素、芥子酸等成分的生物合成机制奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种及质粒 E. coli DH5α、根癌农杆菌（A. tumefaciens）LBA4404、植物表达中间载体pCambia2301G均由重庆市油菜工程技术研究中心保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

植　物　学　报　1995,37(8):581—588Acta Bot anica SinicaphbB、phbC基因克隆、序列分析及植物表达载体的构建谢安勇　崔晓江*　宋艳茹(中国科学院植物研究所,北京100044)摘 要利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从真养产碱杆菌A lcaligenes eutr op hus H16染色体DN A中扩增并克隆了调控聚- -羟基丁酸(poly- -hydro xy butyr ate,P HB)生物合成的两个关键酶基因:依赖N A DPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)和PHB合成酶基因(phbC)。

限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析证实了克隆结果,并表明所克隆的基因与国外报道的有很高的同源性。

经过基因拼接,构建了块茎特异性表达的高等植物表达载体pPSA GB(嵌合phbB)、pBI BGC(嵌合phbC)和pPSA GCB(嵌合phbB和phbC双基因)。

关键词　聚合酶链式反应;phbB;phbC;基因克隆;植物表达载体CLONING AND S EQUENCING OF PHBB AND PHBC INALCALIGENES EUTROPHUS H16AND CONS TRUCTION OF THEIR PLANT EXPRESSION VECTORSXie An-yong,Cui Xiao-jiang and Song Yan-ru(Institute of B otany,Academia S inica,Bei jin g100044)AbstractNADPH-dependent acetoacety l-CoA reductase g ene(phbB)and poly- -hydrox ybu-tyrate(PHB)sy nthase gene(phbC)for biosy nthesis of PHB w ere am plified and cloned from chromosomal DNA of Alcaligenes eutrop hus H16using PCR.The restriction maps and sequencing results show that both phbB and phbC have been cloned.It w as found that the two g enes cloned were highly hom ologous in DNA sequences to those being reported abroad. By DNA processing,the authors have constructed three tuber-specific plant ex pression vec-tors:pPSAGB(containing phbB),pBIBGC(containing phbC)and pPSAGCB(containing both phbB and phbC).收稿日期:1994-11-17　接受日期:1995-03-01　*中国科学院微生物研究所,北京100080。

基因组学与应用生物学，２００９年，第２８卷，第２期，第２２９—２３６页　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，Ｖｏ１．２８，Ｎｏ．２，２２９—２３６　

研究报告　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｐｏｒｔ　

玉米　ｃ基因植物表达载体构建及菊花转化　王娟韩科厅戴思兰　北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术研究中心，北京，１０００８３　通讯作者，ｓｉｌａｎｄａｉ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ　

摘　要　ｃ基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因，它在多种植物中的异源表达可以增　加花青素的含量。本研究对ｐＢＩ１２１载体Ｇｕｓ基因后的终止子进行２次ＰＣＲ扩增，在原Ｓａｃ　Ｉ酶切位点后添　加了新的Ｓａｃ　Ｉ酶切位点，利用组织化学染色法检测，结果表明改造后的载体上的Ｇｕｓ基因能正常表达，终　止子功能正常，载体改造成功。用改造的ｐＢＩ１２１Ｎ构建了含有　ｃ基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１Ｎ—Ｌｃ，利用农　杆菌介导法转化菊花叶盘，获得了ｌ９株生根抗性苗。通过提取抗性苗基因组总ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增￡ｃ基因和　ＣａＭｖ３５Ｓ启动子获得了ｌ１个阳性株系，ＰＣＲ结果表明　ｃ基因已经转入菊花中。同时，在己获得的转基因植　株中发现７个株系的根系有变红的现象。　关键词　玉米，　ｃ基因，载体构建，菊花，遗传转化　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｗｉｔｈ　Ｍａｉｚｅ　Ｌｃ　Ｇｅｎｅ　

Ｗａｎｇ　Ｊｕａｎ　Ｈａｎ　Ｋｅｔｉｎｇ　Ｄａｉ　Ｓｉｌａｎ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＬａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００８３　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，ｓｉｌａｎｄａｉ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｇａｂ．０２８．０００２２９　

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。

枣树Zj2-CP基因植物表达载体构建与功能验证【摘要】：枣树(Zizyphusjujuba)属鼠李科枣属植物,又称为华枣、红枣、普通枣。

早在三千多年前枣树就是我国的主要经济树种,枣树的种质资源丰富,范围几乎分布全国的各个省份,主要分布于淮河及秦岭以北的丘陵、山区,它耐旱、抗盐碱、耐瘠薄。

枣苗经过干旱和盐胁迫后对其生理特性测定发现,枣苗不同组织中几种抗氧化酶活性的表达量均比对照组高。

进行实时荧光定量分析结果表明：随着胁迫时间的2-半胱氨酸氧化还原酶基因的相对表达量均高于对照组,说明2-半胱氨酸氧化还原酶基因有提高植株抗旱和耐盐的功能。

对枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因进行序列分析表明：该序列cDNA全长为834bp,编码277个氨基酸,分子量为30.65KD,理论等电点为8.95,CG含量为45.68%,不稳定系数为41.56,脂溶指数为87.29,疏水性平均值为-0.12,此蛋白为膜外非分泌性蛋白。

该基因编码的蛋白与已知物种2-半胱氨酸氧化还原酶基因编码蛋白的同源性为82%—99%,故将该基因命名为枣树2-半胱氨酸氧化还原酶(Zizyphusjujuba2-cysperoxiredoxin,Zj2-CP),DDBJ/EMBL/GenBank注册号为AB812086。

将Zj2-CP连接到PEZR(K)-LNY,构建了植物表达载体PEZR(K)-LNY-Zj2-CP。

通过冻融法将构建成功的植物表达载体转入农杆菌感受态细胞中,通过农杆菌介导法将阳性菌株转入拟南芥体内,经卡那霉素抗性筛选后共获得15个纯和的转基因拟南芥植株。

通过激光共聚焦分析表明Zj2-CP在转基因拟南芥的不同组织部位,根、茎、叶中均有不同程度的表达。

转Zj2-CP拟南芥和野生型拟南芥种子和植株胁迫处理发现,转基因拟南芥在50mmol.L-1—200mmol.L-1不同盐浓度的胁迫条件下其生长状况明显好于野生型拟南芥的生长状况,无处理转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状况基本相似,在300mmol.L-1、400mmol.L”1条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥均不发芽,可见在一定的盐浓度条件下可以提高转基因拟南芥植株的抗盐性。

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。

植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。

本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。

关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。

而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。

随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。

传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。

从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。

本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。