山楂果实中主要活性物质研究
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山楂果实中主要活性物质研究 摘要：对山楂果主要活性物质的研究，首先，进行了山楂果总的液相色谱鉴定、黄酮类提取分离及生理活性探究，继而，对黄酮类代表原花青素，和三萜类代表熊果酸的化学结构、提取分离、结构鉴定（红外、紫外、 质谱、核磁共振）、生理活性展开论述。 关键词：山楂、原花青素、熊果酸
山楂属植物为蔷薇科，分布于北温带，世界有该属植物1000余种。山楂品种复杂，《中国植物志》载：本属植物我国有17种，中国药典(2000年版规定中药山楂原植物为北山楂（Crataegus pinnatifida)和山里红(C.pinnatifida Var Major)的果实。近年来，国内外学者对其原植物、化学、炮制、理及临床研究都有较大发展。山楂在我国是一种重要的化滞中药，经本草考证山楂之名始载于《本草纲目》，在此之前以“赤爪草’’之名始载《新修本草》，历来为药食两用之佳。近几十年来，更广泛用于治疗心血管疾病。【1】 1、山楂的研究 1.1山楂的化学成分 山楂的主要成分是黄酮类物质，对心血管系统有明显的药理作用。目前， 从山楂中分离的黄酮成分有30 余种，主要有含碳键的黄酮苷类、黄酮醇及其苷类、双氧黄酮苷类、聚合黄酮类。 另一类较为重要的成分是三萜类物质，有强心、增加冠脉血流、改善血流循环等重要作用。 此外，山楂中含有机酸如氯原酸、咖啡酸及鞣质、鞣酐、表儿茶酚、 胆碱、乙酰胆碱、β谷甾醇、胡萝卜素等。 其他成分有蛋白质、糖类、维生素类等。 其中，黄酮类代表，以儿茶素、表儿茶素为单元的原花青素类(procyanidins，简称PC)，其在标准化提取物中含量达20％左右；以及，三萜类代表，熊果酸。（本文主要介绍） 1.2 总黄酮提取分离方法 a.提取方法：①永煎煮提取：山楂果肉30 g，用蒸攘水蘸煮2次，滤过，浓缩，褥山楂浸膏。②乙醇回流提取：取山楂果肉30 g，以60％乙醇阐流提 取2次，每次l。5 h。合并提取液，圈收乙醇，褥出棱浸膏。③甲醇为溶剂，索氏提取：取山横果肉30 g，戳荦醇为溶剂，用索氏提取器匿流提取4 h，隧收甲醇，得山榱浸膏。④超声提取：取山楂果肉30 g，加60％乙醇，超声3次，每次45 min，合并提取液，回收乙醇，得山楂浸膏。 b.大孔吸收树脂分离提取总黄酮：将所得山楂浸膏分别加入适量蒸馏水，搅匀，加入CaCl21 g，静置过夜。离心，分别收集上清液，用氨水调pH至7～8，分别加入大孔吸附树脂柱中，调节流速5 mL／min，用蒸馏水洗去杂质，以乙醇为流动相解吸附，回收乙醇，得总黄酮提取物。将水提取物稀释成含生药1 g／lO mL的溶液，其他提取物稀释成含生药1 g／200 mL的溶液，分别测定总黄酮含量。 1.3 山楂的结构鉴定
山楂果实中活性成分分析的HPLC谱图 1．未知前花青素二聚体；2．未知前花青素三聚体；3．未知前花青素四聚体；4．绿原酸；5．前花青素B2；6．异绿原酸；7．未知酚酸；8．前花青素C．；9，表儿茶素；10．未知成分；11．未知成分；12．前花青素Bs；13．金丝桃14．Isoquereitrin． 1.4 生理活性 1.4.1 心血管作用 a. 降血脂作用：学者对山楂黄酮调节脂质代谢作用进行了大量研究(冯凤莲等，1997)，研究表明山楂及山楂黄酮能显著降低血清和肝脏丙二醛(MDA)含量，增强红细胞和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)的活性。同时增强全血谷胱甘肽还原酶(GSH．Px)活性。还能显著抑制喂高脂高胆固醇饲料大鼠的血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白一胆固醇(LDL-C)和ApoB浓度，显著升高高密度脂蛋白．胆固醇(HDL-C)和ApoAl浓度，但对甘油三酯(TG)影响不大。 b. 降压作用：山楂黄酮、三萜酸及水解物静注、腹腔注射、十二指肠给药，对麻醉猫的血压均显示不同程度的降压效应。山楂三萜酸在20．40medkg范围以25mg／kg静注降压作用最强，再加大剂量其降压效应亦不相应增加。山楂黄酮、三萜酸水解物以同等剂量(25mg／kg)静注比较，以三萜酸降压效应最明显；但产生显著降压作用之剂量以黄酮为最低(沈映君，2000)。 c. 舒张血管作用：山楂总黄酮可增加冠脉流量，抗实验性心肌缺氧，抗心率失常等作用，山楂提取液无论体内或体外给药均可显著抑制家兔血小板凝集性，这对冠心病等心血管疾病的防治显然是有益的(Schussler M．，1995)。 1.4.2 对消化系统的作用 山楂提取物有增加胃液分泌的作用，还能增加胃中酶类，所含脂肪酶可促进 脂肪分解，山楂酸等可提高蛋白质分解酶的活性，有助消化作用(尹卫靖,1996)。 1.4.3 对中枢神经系统的作用 山楂能显著延长小鼠睡眠持续时间。小鼠腹腔注射山楂2．59／kg(按生药计)20min后，给予戊巴比妥钠，观察小鼠睡眠持续时间。结果发现对照组31．8± 20．1rain，山楂组88．3±38．9min。用药组和对照组比较(P常显著，说明山楂能显著延长小鼠睡眠持续时间。 1.4.4 利尿作用 山楂浸膏具有利尿作用。给药60rain时尿量较给药前增加44．2％，90min 增加53．9％，120min增加63．7％，可见其利尿作用温和、缓慢而持久，而且山楂利尿时对电解质影响较小，血钾水平无明显变化。 1.4.5 耐缺氧作用 低压缺氧实验表明，山楂与～心得安”一样有非常显著的耐受低压缺氧作用。常压缺氧实验山楂可显著延长小鼠存活时间。对小鼠耗氧量实验表明无论自身比较或组间比较，山楂均有显著减低小鼠整体耗氧量作用(Bahorum T．et a1．，1996)山楂果肉原花青素的提取、纯化、结构鉴定及生物活性的研究 1.4.6 抗氧化作用 山楂叶乙醇提取物对羟自由基和超氧阴离子的生成有清除和抑制作用，其 作用随提取物的百分比浓度增加而增加。山楂叶的抗氧化作用的活性物质是山 楂叶中的主要成份黄酮，因为黄酮是公认最具抗氧化潜力的一类化合物。 1.4.7 抗癌、防癌作用 药物学家研究发现，山楂中所含黄酮类药效成分中，牡荆素具有抗癌作用。 山楂中的生物类黄酮包括牡荆素等主要通过3个途径达到抗癌、防癌的作用，增 强机体的非特异免疫功能。例如400mg／mL山楂提取液能阻断强致癌物--7,基亚 硝胺的合成，这种作用可比同量维生素C的阻断能力强3倍，且阻断反应迅速、 持久。山楂提取物能有效防止大鼠因灌喂亚硝酸钠和甲基节胺溶液所引起的食管 癌和前胃乳头状瘤，表明山楂提取物对体内合成甲基亚硝胺诱癌有显著的阻断作 用。 1.4.8 抗菌作用 山楂果水煎剂Lg／mL，(生药)对志贺氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、白色 葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、蔡氏球菌、溶血性链球 菌、福氏痢疾杆菌、白喉杆菌、伤寒杆菌均有较强的抗菌作用。 2、原花青素的研究概述【2】 原花青素(Proanthocyanidins，简称PC)是植物王国中广泛存在的一大类多 酚化合物的总称。1961年，德国的Karl E等人从山楂新鲜果实的乙醇提取物中 首次分离出2种多酚化合物；1967年，美国Joslyn M．A等又从葡萄皮和葡萄籽 提取物中分离出4种多酚化合物，他们得到的多酚化合物在酸性介质中加热均可 产生花青素，故将这类多酚化合物命名为原花青素。 2．1 化学结构 在结构上，原花青素是由不同数量的儿茶素（catechin）或表儿茶素（epicatechin）结合而成。最简单的原花青素是儿茶素、或表儿茶素、或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二～五聚体称为低聚体（简称OPC），将五聚体以上的称为高聚体（简称PPC）。
原花青素结构通式 2.2 提取分离方法 原花青素的提取一般采用溶剂提取法。提取溶剂一般采用甲醇、丙酮等有机溶剂。进行分离、纯化时，也多采用有机溶剂，如乙醚、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等。 分离包括溶剂萃取、膜过滤或超滤、反渗透及色谱法。溶剂萃取一般采用乙酸乙酯，乙酸乙酯属中等极性溶剂，可以选择性地萃取原花青素低聚体(DPI．7)，用于粗提物的初步纯化，萃取后用氯仿或石油醚沉淀其中的原花青素，或进一步用柱色谱提纯。美国专利中对超滤及反渗透的应用也比较多，如用超滤膜除去相对分子量>5000的杂质及高分子量的原花青素，再用反渗透除去小分子杂质，结合柱色谱分离，可以得到纯度较高的原花青素(US Patent 5912363)。 2.3 结构鉴定方法 2.3.1 山楂果肉原花青素紫外可见光谱 参考文献(Kennedy et al.，2001)中原花青素的结构通式可知，原花青素结 构单元中含有苯环，且苯环上有—OH取代基，使苯环的B带(255nm)显著红移，使原花青素在280nm附近有特征吸收峰。
2.3.2 山楂果肉原花青素红外光谱 下图为葡萄籽原花青素标品的瓜光谱图3300cm-1左右的吸收峰为原花青素分子中羟基的伸缩振动；2360cm-1左右，1600cm-1左右，1500cm-1左右，1400cm-1左右是苯环的骨架振动特征吸收；指纹区800-650cm-1出现较强的吸收峰，表明苯环上有邻对位多取代基；1270cm-1左右和llOOcm-1左右吸收峰为C环中的C-O-C伸缩振动。
2.3.3 原花青素的ESI—MS分析【3】 将100ug／mL的CSPCs直接进样，进行ESI—MS分析，得到经大孔树脂纯化后CSPCs的分子量范围为289.4～1154.9，对应的m／z(质荷比)峰分别为577.2、289.4、865.2、1154.9。
