基因丢失或失活在肿瘤发生中的作用研究进展

遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ　（Ｂｅｉｊｉｎｇ）　１３　（３）４６－４９　１９９１

基因丢失或失活在肿瘤发生中的作用研究进展

一、肿痛组织等位基因丢失的检出策略与机理由于在癌变过程中，以ＲＢ为代表的隐性癌基因

Ｈｕａｎｇ　Ｊｉａｎｈｕａ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｌｏｓｓ　ｏｒ

Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ本文于１９８９年１２月４日收到。

一综述

黄建华吴吴（中国医学科学院肿瘤研究所，北京，１０００２１）在癌变原理的研究中，分子肿瘤学领域取得了令人瞩目的成就，发现了与肿瘤发生密切相关的两类基因。第一类是所谓的癌基因（原癌基因），它们是细胞的正常基因，在演化中高度保守，在细胞正常生长和分化过程中有着重要的生理功能。但在外界致癌因素的作用下，通过点突变、ＤＮＡ重排和基因扩增等方式使这些癌基因激活而导致肿瘤发生。在体外的试验中，用已激活的癌基因去转染特定实验动物细胞，可以使这些受试细胞发生恶性转化。因此，在细胞水平上，癌基因的致癌方式是显性的。第二类可称为抗癌基因，这是新近在视Ｆ１膜母细胞瘤（简称ＲＢ）的研究中所取得的重大突破。根据某些家族性ＲＢ病人在染色体”ｑ１４区域出现缺失的线索和用连锁分析所检测到的１３ｑ１４处存在特异基因丢失的资料，用分子克隆的方法，在染色体这个区域分离到了ＲＢ基因。这是第一个克隆到的抗癌基因。对ＲＢ基因结构和功能的研究表明，该基因在ＲＢ的发病中起着至关重要的作用。它的正常存在与表达能够阻止视网膜母细胞癌变，并促使细胞发生正常分化，故被命名为坑窟基因‘Ａｎｔｉｏｎ－ｃｏｇｅｎｅ）或抑癌基因（Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　Ｇｅｎｅ）ｔ２ｓ，２４１ａ在作用方式上ＲＢ基因与起显性作用的癌基因有着明显的区别，即在两个正常ＲＢ等位基因全部丢失或失活时，肿瘤才会发生。基于这种隐性作用方式，又被称为隐性癌基因（Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）。由于这类基因是通过染色体缺失而被发现的，而携带这种缺失的个体极易发生这种肿瘤，由此也称这种基因为肿瘤易感基因（Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｇｅｎｅ）。在ＲＢ的研究中，人们首次获得了一个特定隐性癌基因的丢失或失活与人类肿瘤发生之间有关的直接证据，开拓了人们认识癌变的眼界，开始关注特异基因的丢失或失活在癌变中所起的作用。研究类似过程是否也发生在其它肿瘤中，采取什么策略能够检测出肿瘤组织的基因丢失，以及这些基因丢失在肿瘤的发生和发展中可能存在哪些意义等间题。本文就这几方面的研究进展作一简要概述。的致癌作用是以两个正常等位基因全部丢失或失活为特征的，因此在肿瘤细胞中很难直接检出这些基因的存在和异常。使用什么策略才能发现肿瘤细胞中丢失了与肿瘤发生密切相关的基因呢？这是一个首先要解决的难题。１９８３年Ｃａｖｅｎｅｅ首创了用ＲＦ卜Ｆ连锁分析的方法用以检测肿瘤细胞基因组等位基因丢失或杂合性消失〔”。在ＲＢ的研究中取得了成功，并为研究各种肿瘤基因丢失开辟了新路。限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ），是指在基因组ＤＮＡ中，限制性内切酶识别部位所限定的、在不同个体中长度不一致的ＤＮＡ序列。这些ＲＦＬＰ大多产生于碱基替代而造成的内切酶位点的得失，一般只能在人群中检测到二种形式即该酶切点有或无〔２，４３０Ｃａｖｅｎｅｅ等人所采取的策略为在同一肿瘤息者身上取肿瘤组织和正常体细胞（如淋巴细胞），提取基因组ＤＮＡ，用某种限制酶消化，通过琼脂塘凝胶电泳将这些大小不同的酶解片段进行分离，形成一定的分布区带，然后用各个已定位在特定染色体的多态ＤＮＡ探针与其杂交。以正常组织基因组杂合型ＲＦＬＰ多态位点为对照，对比分析肿瘤组织基因组在相同多态位点的杂合性有无改变。如果肿瘤组织ＤＮＡ序列本身发生变化，缺失了某一等位片段，则该位点将由杂合状态变成半合状态。这样就能够分析出与该标记ＤＮＡ位点紧密相联的目的基因有无等位基因缺失或变为纯合子。所以只有标记ＤＮＡ多态位点为杂合子的个体才能提供有用的信息。ＲＢ基因根据染色休检查和遗传连锁分析资料定位在染色体１３ｇ１４区段［ａ，ｘａｌ，　Ｃａｖｅｎｅｅ选择了７个与ＲＢ基因紧密连锁的ＤＮＡ片段做探针，检测了ＲＢ病人瘤组织和正常体细胞的ＲＦＬＰ，杂交结果表明，在ＲＢ基因位点上，正常体细胞呈杂合状态的个体，在肿瘤组织中却出现了半合和纯合的显著改变。此外，又检查对照了其它染色体的８个ＤＮＡ片段的杂交结果，相同病人的正常一肿瘤标本对，几乎均为相同的杂合性结果。这些实验资料强烈地提示ＲＢ病人在染色体１３８１４的ＲＢ基因位点上有特异性的基因丢失，它与ＲＥ的发生密切相关。Ｃａｖｅｎｅｅ阐述了在肿瘤组织内野生型等位基因被排除的机理并归纳了ＲＦＬＰ分析的结果。１．有丝分裂不分离使野生型染色体丢失，造成了１３号染色体所有位点的半合性。这样杂交结果显示野生型ＲＥ基因所在的染色体的标记ＤＮＡ片段丢失，突变染色体的标记ＤＮＡ片段杂交密度无增加。２．有丝分裂的不分离使野生型染色体丢失，同时突变的染色体再复制，从而使突变基因变为纯合。因此，这条染色体突变基因的多态片段杂交密度是体细胞的两倍熟而另一等位片段则消失。３．突变的和野生型的１３号染色体之间发生有丝分裂重组，断点在ＲＥ座位和着丝粒之间，这样近着丝粒侧的基因座位保持原来的杂合状态，但包括ＲＢ座位的其余染色体片段则变成了纯合状态。斗．第二次突变仅限于ＲＥ座位内，如基因转换、微小缺失或点突变，ＲＦＬＰ分析不能显示肿瘤细胞基因组ＲＢ等位基因有无丢失。这样通过以上这些事件将肿瘤组织内野生型等位基因排除，导致隐性突变的ＲＥ基因成为纯合子或半合子，使ＲＥ基因的两个成员的正常功能全部丧失。二、ＲＢ基因在肿瘤中的丢失现在，人们在染色体１３ｇ１４区带，直接分离、克隆出了ＲＢ基因的ｃＤＮＡ序列〔‘，’。，‘”。并证实正常ＲＥ基因存在于受检的淋巴细胞、正常胎儿视网膜、视网膜细胞株、以及其它一些类型的肿瘤。但是在ＲＥ的癌细胞中这个基因有纯合和半合的缺失，或表现为ｍＲＮＡ转译的异常表达。这就在分子水平上充分证明了ＲＥ基因是隐性癌基因，由于染色体缺失、ＤＮＡ部分丢失、点突变以及有丝分裂的染色体重排机制，使ＲＥ基因在ＤＮＡ水平上出现异常，而使这两个等位基因的功能全部丧失。与此同时，ＲＥ基因的克隆也验证了ＲＦＬＰ的方法检测肿瘤基因丢失的准确性和可靠性。目前还有一些资料表明，ＲＢ基因的失活不仅与视网膜母细胞瘤的发生有关，还可能同少数不同组织起源的肿瘤发生有关。１９８８年Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ用ＲＢ基因做探针，检测了３０例散发型成骨肉瘤，４３．３％的病人ＲＥ基因全部或部分丢失‘２＂ｏ　１９８７年Ｌｕｎｄｂｅｒｇ用ＲＥ基因座位紧密连锁的多态ＤＮＡ探针，检侧了１０例乳腺导管癌的ＲＦＬＰ，结果显示４例病人癌组织在这个位点上为纯合缺失或失活状态‘，‘，。１９８８年，Ｈａｒｂｏｕｒ等用ＲＥ　ｃＤＮＡ序列作探针，检测了８例原发性小细胞肺癌病人和５０例各种病理类型肺癌细胞株。发现１３％ｏ的原发性小细胞肺癌和１８％的小细胞肺癌细胞株有该基因位点的缺失，并且６０％的小细胞肺癌细胞株没有ＲＢｍＤＮＡ表达，在９０９ｆ０的非小细胞肺痛株和正常肺组织中ＲＢｍＤＮＡ则表达正常‘川。三、结肠癌的等位签因丢失最近，在常见肿瘤结肠癌中获得了特异性基因丢失的资料。１９８６年，英国人首先报道了一个家族性结肠息肉（Ｆａｍｉｌｉａｌ　Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ，简称ＦＡＰ）的患者体细胞的染色体有５ｇ２１－９２＇２的缺失〔，，’。根据这一线索，１９８７年Ｂｏｄｍｅｒ等用ＲＦＬＰ的方法检测了ＦＡＰ家族，把ＦＡＰ基因定位于染色体，ｑ２１－ｑ２２的区带，并认为这个区域可能对结肠上皮的恶变具有重要意义Ｆ”。同年Ｓｏｌｏｍｏｎ选择了与ＦＡＰ基因紧密连锁的两个探针，检测了４５例结肠癌病人的ＲＦＬＰ，结果表明有２３％的病人在ＦＡＰ基因位点显示部分或全部等位基因丢失，与其它６条染色体的ＲＦＬＰ结果比较，发现在５ｑ末端的等位基因丢失不是随机丢失的结果。作者认为通过与ＲＢ相似的隐性癌变机制，使ＦＡＰ基因功能丢失而使肿瘤发生〔，。’。像ＲＢ基因一样，目前正集中力量分离ＦＡＰ基因，并对它的功能作

出评价。１９８８年Ｏｋｓｍｏｔ“等不仅选用５ｑ末端的探针，并且也使用了其它染色体的探针，分析了２５例家族性结肠息肉病（Ｆａｍｉｌｉａｌ　Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　Ｃｏｌｉ简称ＦＰＣ）和１９例散发型结肠癌的ＲＦＬＰ，他用与ＦＡＰ基因紧密连锁的探针Ｃｌ１Ｐ１１，证实了在５ｑ　ＦＡＰ基因位点上，ＦＰＣ的结肠癌和散发性结肠癌的肺瘤组织中均有该基因位点的杂合性丢失，认为这个基因的丢失在结肠癌中起关键作用。同时，作者还利用１２ｑ上的多态深针Ｄ１２Ｓ７和Ｄ１２ＳＢ检测，发现这些病人的肿瘤组织也有杂合性丢失，而１２Ｐ的Ｋ－ｒａｓ２位点保持原有的杂合性，说明１２号染色体部分缺失而不是整条染色体丢失。由于在结肠腺瘤中也有这一丢失，表明这一染色体区域的改变可能与肿瘤发生初期改变相关。同时还发现在６，　１５，　２２号染色体上也存在着杂合性丢失，范围在１３－２５９ｏ。作者对所见到的等位基因丢失提出了三种可能的解释：１．ＦＰＣ基因可能位于所测得的杂合性丢失的一条染色体上兰２．等位基因丢失可能是肿瘤发生所必需经历的继发性染色体改变，它可能在ＦＡＰ基因或位于不同染色体上其它与结肠癌有关基因所发生另一次突变之后而产生；３．等位基因丢失的原因可能是肿瘤发生期间异常有丝分裂的结果，与肿瘤病因无关。这些均提示ＦＰＣ的肿瘤发生不是简单的，而是多途径的复杂过程。‘’。

四、肺癌的基因丢失１９８７年Ｙｏｋｏｔａ根据小细胞肺癌有染色休３ｐ缺失的依据，使用多态的３号染色体ＤＮＡ探针，检测了新鲜肺肿瘤组织的ＲＦＬＰ。发现小细胞肺癌在染色体３ｐ，　１３ｑ和１７ｐ都存在１００％的杂合性丢失，肺腺癌也