HPV疫苗的研究进展
摘要：子宫颈癌是引起女性死亡的第二大癌症。研究证实人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与子宫颈癌有着十分密切的关系。近年来，ＨＰＶ疫苗在预防和治疗子宫颈癌方面备受关注，关于HPV疫苗研究已经取得了很大的进展。本文就HPV疫苗的研究进展做一综述。
关键词：人乳头瘤病毒;子宫颈癌;HPV疫苗
Progress in research on human papillomavirus vaccine
Zhang Ting(Obstetrics and Gynecology Department of The Third Xiangya
Hospital, Central South University )
Abstract: Cervical cancer is the second cause of cancer death in women, many studies confirm that human papilloma virus (HPV) infection and cervical cancer has a very close relationship. In recent years, HPV vaccines get much attention in the fields of cervical cancer prevention and treatment, and great progress has been made in it. This paper focused on the progress HPV vaccine researching.
Key Words: human papilloma virus; cervical cancer; HPV vaccine
宫颈癌是导致女性死亡的第2位恶性肿瘤，每年大约死亡50万人。在西方发达国家，宫颈癌筛查方法的有效实施使该病的死亡人数急剧下降[1]，但在那些社会经济不发达的地区，宫颈癌不仅相当常见，而且多为晚期，预后很差。流行病学以及病毒学资料已经证实，HPV 感染与宫颈癌的发生发展有密切的内在联系[2]。分子生物学及免学等多学科的发展及其在动物模型中对HPV疫苗研究取得的进展，进一步推动了HPV（human papilloma virus，人乳头状瘤病毒）疫苗在治疗宫颈癌方面的研究。
1 HPV的地域分布及感染特点
1.1 HPV是含有大约8000个碱基对的双链DNA病毒，并按照其致癌特性分为高危型和低危型，HPV16，18，52，33，45，39等均属高危型，它们与CIN2级与CIN3级密切相关，其中HPV16和18与71%的宫颈癌有关 [3]。HPV16是在所有国家中最为常见的一类，其他类型的HPV的患病率因地理位置的差别而有所差异，如HPV45在非洲西部常见，而HPV39多见于非洲中部及南部。相同基因型的HPV中存在多样的基因组型是与史前时代种族分离进化相关的，这些变异体之间的区别是在其DNA内容物的1%～5%。在墨西哥的人口中HPV16变异体数量和美国、印第安地区相比，比预期的高出很多，相反，HPV18变异体在欧
洲比在非洲常见。
1.2 HPV感染是一个动态的过程，该病毒的自发清除以及多类型HPV联合感染常见。已有证据表明，在性活跃人群中，HPV感染是常见并且短暂的，只有那些长期感染高危型HPV的病人才有罹患宫颈癌的危险，这是因为HPV感染及宫颈癌前病变有较高的自愈能力。目前，已
有一些研究，其目的在于观察HPV感染的自然病程和自发清除率。一项加拿大的调查中发现，HPV16的24个月累计感染率最高(12%)，感染时间最长(平均持续18.3个月)，其次是HPV31(平均感染14.6个月)。一项哥伦比亚研究显示，与其他HPV类型相比，HPV16及其相关基因型(31,33,35,52,58)具有较低的清除率。另有资料显示，非欧洲的HPV16变异体的自发清除率较低，并因此表现出了更强的致癌性。
2 HPV预防性疫苗及其临床试验成果、前景
预防性疫苗可诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫反应，达到有效预防与癌症相关型HPV的传播，降低宫颈癌的发生率。纯预防性疫苗适用于未感染HPV的人群，尤其是性活动初始的个体，这类疫苗可在黏膜及其分泌物中产生足够高的抗体滴度，由组织中的固有B细胞合成的同型渗出物IgG和分泌型IgA在动物模型中显示了很好的作用。目前最完善的预防性疫苗是病毒样颗粒（virus-likeparticle,VLP），由病毒主要衣壳蛋白L1组成，并表现出了很好的免疫原性及耐受性。HPV16L1VLP疫苗对预防HPV感染、持续存在及CIN具有100%的有效性[4]。感染部位免疫球蛋白的数量是产生保护作用的关键环节。Nardelli-Haefliger等[5]进行了一项月经周期中宫颈分泌免疫球蛋白数量的研究，发现在排卵期前后免疫球蛋白浓度降低了9倍左右，但服用口服避孕药的妇女无明显变化。免疫球蛋白数量的减少是否会降低保护作用仍在研究中，但已有研究证明，排卵前期宫颈部位较高的抗体滴度以及观察100%有效率的疫苗均证实保护作用并未降低。
目前，关于L1转基因植物的研究也在进行中。Biemelt等[6]已经证明L1转基因植物可合成VLPs。此外，Warzecha等[7]发现用HPV16L1及HPV11L1的转基因土豆喂养动物后可引发动物体内的保护性免疫。还有部分预防性疫苗采用DNA疫苗，目前一种病毒载体的预防性疫苗以单剂量的免疫方式进行动物实验，利用水疱性口炎病毒载体融合兔乳头状瘤病毒（Cottontail rabbit papilloma virus,CRPV）L1免疫后可激发动物体内高水平的抗L1抗体从而保护机体不受CRPV的感染，而保护作用呈L1剂量依赖性[8]。一项动物实验比较几种不同类型的HPV预防性疫苗（包括VLPs，嵌和体VLPs，质粒DNA，腺病毒载体），发现经HPV16L1VLPs免疫后体内可产生强烈的中和抗体及L1特异性Th2的体液免疫应答，相比之下，经HPV16质粒DNA或者经腺病毒载体表达的HPV16L1免疫后可产生强烈的Th1/Tc1辅助性免疫应答，但产生中和抗体很弱，这说明了以HPV16L1VLP为基础的疫苗可产生强烈的中和抗体，而这正是有效预防HPV感染所必不可少的[9]。
目前，HPV预防性疫苗都取得了一定的成果，在预防HPV感染方面也有了长足的进步[10]。但是，有研究显示在HPV疫苗的实施中存在如下问题：①在发达国家，疫苗抗原的生产面临低经济预算的问题，这意味着生产疫苗的能力还有待于进一步提高。而在发展中国家经济问题更为突出，比如，正在临床实验的VLPs疫苗就已超出了发展中国家人群的购买力，因此，相对经济的改良型疫苗应继续开发,同时政府应给予相应的经济支持。②由于部分被免疫后人群相信，疫苗可使他们免于HPV感染或者宫颈癌，因而可能会进行更高危的性活动并忽视常规的妇科检查，但是疫苗无法防御所有类型的HPV感染，所以这类人群是危险的，而且疫苗的保护时间可能是有限的，因此定期的妇科检查十分必要。③任何一种疫苗的效果主要取决于疫苗的足量应用。预防性HPV疫苗最主要的目标人群是学龄儿童和青少年，但是对这类人群接种疫苗是存在困难的，家长们缺乏相应的知识，认为接种疫苗有损健康，不利于疫苗接种的推广。④临床医师们也存在着对疫苗安全性和有效性的担忧，由于社会等多方面因素，他们与青少年谈论性行为和性传播疾病（sexually transmitteddisease,STD）存在一定困难，而且医师们认为其他疫苗（如乙肝疫苗等）应优先于HPV疫苗的接种。
3宫颈癌治疗性HPV疫苗
宫颈癌HPV治疗性疫苗旨在是通过细胞免疫和体液免疫,减少或消除体内已受HPV感染的细胞甚至肿瘤细胞,并防止癌前病变继续恶化。研发高效安全的治疗性HPV疫苗已成为HPV 相关疾病领域研究的一个热点。其中E6、E7蛋白是HPV阳性的肿瘤细胞表达的癌蛋白,最适合作为治疗性HPV疫苗的特异性靶抗原。因此,治疗性疫苗主要直接针对E6和E7抗原。治疗性疫苗包括载体疫苗、肽类疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗及细胞疫苗等。此外,HPV E2疫苗的研究也值得关注。
3. 1载体疫苗
3. 1. 1病毒载体疫苗病毒载体疫苗是将靶抗原编码基因插入无毒、减毒、弱毒的病毒
中所制成的疫苗,可诱导特异性免疫反应,并且其本身可作为免疫佐剂。此类型疫苗的优点在于有高度免疫原性,研究较多的有牛痘病毒疫苗、腺病毒疫苗等。Garcia-Hernandez 等［11］将重组MVA-E2 疫苗注射至34 例CINⅡ/Ⅲ患者的子宫，每周1 次，连续6 周以上; 组织学分析发现，该疫苗能有效清除病变并显著减少HPV 负荷，其中20 例病变消除， 11 例病灶体积减少50%，2 例降为CINⅡ、1 例降为CINⅠ。Zhou 等［12］将HSP70-E7 融合腺病毒疫苗注射到小鼠体内，可诱导特异性的CTL 反应; 并且用高浓度TC-1 肿瘤细胞侵袭这些小鼠，小鼠对初次及第2 次肿瘤细胞侵袭的抵抗力为100%，对第3 次肿瘤细胞侵袭的保护率仍有70%。但此类疫苗对免疫抑制的宿主存在危险性，而且由于各种重组载体对目的基因产生的蛋白可进行不同的修饰加工，最终影响其免疫原性。
3． 1． 2 细菌载体疫苗细菌载体疫苗是将编码HPV 特异性抗原的DNA 片段插入减毒病原菌或共生菌中，并呈递该抗原，以达到治病目的。此疫苗免疫原性高，常用的细菌载体主要有链球菌、乳酸杆菌、结核杆菌、李斯特菌、伤寒杆菌等。研究发现，向小鼠体内注射溶链菌制剂，可成功诱导产生E7 特异性的CD4+ T 和自然杀伤细胞而激发机体产生抗肿瘤免疫效应［13］。Quistian-Martinez 等［14］发现，乳酸杆菌疫苗可诱导受HPV 感染的黏膜和生殖器产生抗肿瘤免疫反应。
3． 2 肽类疫苗肽类疫苗是由E6、E7 与人类白细胞抗原( HLA) 配型的多肽片段制成的疫苗，因多肽疫苗抗原性弱，一般需辅以佐剂。目前FDA 批准的唯一佐剂是Al( OH)3，该佐剂能促进机体体液免疫，但对细胞免疫无促进作用。肽类疫苗能诱导机体产生细胞毒性T 细胞反应，其中最主要的代表为E7 肽类疫苗。目前肽类疫苗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床阶段，并取得了不错的成果。Lee 等［15］研究发现，向CINⅡ/Ⅲ及宫颈癌患者体内注射HPV16 E7 肽类疫苗可诱导机体产生细胞免疫反应。Granadillo 等［16］将LALF( 32-51) 一E7 肽类疫苗( LALF 为佐剂) 注射到HPV16 感染的小鼠体内，可诱导小鼠强烈的T 细胞反应并抑制肿瘤细胞的生长。肽类疫苗临床应用的局限性在于需要匹配特定的HLA 型别。
3． 3 蛋白疫苗早期蛋白E6 和( 或) E7 为蛋白质疫苗的抗原部分，其中E7 免疫原性高于E6。由于E6、E7 蛋白免疫原性较弱，具有潜在的致癌性，且野生型E6、E7 不易被降解，以致其不利于抗原的提呈。因此，E6、E7 蛋白常需融合其它蛋白，以提高其免疫果。蛋白疫苗细胞免疫反应弱、表达水平低。
3． 3． 1 嵌合蛋白疫苗由HPV 晚期蛋白L1 或L2 的末端与早期蛋白相融合而成，既可刺激机体的体液免疫起到预防作用，又可激发机体的细胞免疫起到治疗作用，如L1-E7、L2E7( TA-GW) 、L2E7E6 ( TA-CIN) 等。Freyschmidt 等［17］对HPV16 L1-E7 嵌合蛋白疫苗进行体外实验，结果显示，其可在外周血中诱导T 细胞反应，但T 细胞反应较弱。但发生HPV 感染的患者血清中常存在抗晚期蛋白L1、L2 的抗体，这些抗体会削减嵌合蛋白疫苗的治疗效果。
3． 3． 2 融合蛋白疫苗由HPV早期蛋白相互融合或早期蛋白融合其它蛋白构成，从而更好地激发机体的免疫功能，如E6 /E7、HspE7、PD-E7 融合蛋白等。其中Nventa 公司研发的HspE7 最引人注目，HspE7 是由HPV16 E7 蛋白与牛结核分枝杆菌热休克蛋白65( Hsp65) 融合而成，利用HSP 可将抗原E7 蛋白导入树突状细胞( dendritic cell，DC) 的特性，从而激活E7 特异性的细胞免疫。目前HspE7 已进行了大量的临床试验，临床结果显示，HspE7 对由HPV 引起的相关疾病有较好的治疗效果。Goldstone 等［18］给14 例尖锐湿疣患者注射HspE7，3 例湿疣病灶消失，10 例病灶范围缩小70% ～95%。Derkay 等［19］对27 例儿科复发性呼吸道人乳头瘤病患者注射HspE7，注射后手术需求率显著减少。融合蛋白疫苗无HLA 限制，CTL 反应无需CD4+T 细胞诱导，这对免疫抑制患者具有优势。
3． 4 DNA 疫苗 DNA 疫苗又称基因疫苗，采用基因载体将E6、E7 基因导入抗原递呈细胞，并持续表达抗原蛋白，激发机体产生特异性的免疫应答。Kang 等［20］用γ-干扰素( IFN-
γ) 诱导蛋白-10 来修饰E7 DNA 疫苗，结果显示，IP-10 /E7DNA 疫苗与E7DNA 疫苗相比，通过增强机体的抗原提呈作用及趋化作用，从而刺激机体产生更强大的T 细胞免疫反应。Lee 等［21］用肌肉电穿孔术来注射HPV16 E7 DNA 疫苗，结果发现，此方式可激发机体产生更强大的抗肿瘤效应，并能预防宫颈癌的转移。与肽类疫苗、蛋白疫苗比较，DNA 疫苗具有可持续表达抗原、不需佐剂、易于制成多价疫苗，对多型别HPV 感染所致的宫颈癌效果更好等优势。同时该疫苗免疫原性弱、HPV 基因整合后具有潜在危险性，故其在人体内应用的安全性仍有待观察。3． 5 细胞疫苗
3． 5． 1 DC 疫苗 DC是免疫系统中最有效的专职抗原递呈细胞，表达B7、CD40、MHC Ⅰ、Ⅱ类分子等共刺激分子，诱导初始T 细胞活化，是机体CD4+ 及CD8+ 的始动者。DC 在肿瘤免疫排斥方面的作用受到人们越来越多的关注，已成为宫颈癌治疗性疫苗研究领域的一个新热点。Nurkkala 等［22］发现，将霍乱毒素( CT) 作为佐剂与HPV16 E7 有机结合冲击DC，比单独用CT 或HPV16 E7 冲击DC 能更有效地刺激机体的T 细胞免疫记忆应答。另一项临床实验发现，HPV16mE7-DC 三维结构疫苗较HPV16mE7-DC 二维结构疫苗能更有效地诱导T 细胞免疫反应，并促进细胞因子IL-12p70 及IFN-γ的分泌［23］。然而DC 疫苗制备过程复杂且仅局限于自体应用，故对其进行规模性生产较难以实现。
3． 5． 2 肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗是利用共刺激分子或细胞因子修饰肿瘤细胞以增加免疫原性，免疫后能诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫应答。Murshid 等［24］实验表明，HSP 肿瘤疫苗能刺激抗原提呈细胞的抗原摄取从而激发机体的特异性免疫反应。但该疫苗因向患者体内引入了新的经修饰的肿瘤细胞，其安全性有待观察。
3． 6 HPVE2疫苗 HPV E6、E7 为主要的致癌蛋白，而HPVE2 蛋白能抑制E6、E7 的转录，并与E1 共同调节病毒DNA 的复制。在HPV 整合过程中，许多基因被破坏，其中以E2 基因破坏尤为关键。E2 基因的灭活或丢失，可导致E6、E7 基因编码的致癌蛋白持续过度地表达，并增强两者细胞恶性转化能力［25］。Blakaj 等［26］研究发现，HPVE2 蛋白的氨基酸序列、三维空间结构和其静电特征均具有高度保守性，HPVE2 疫苗有希望成为治疗宫颈癌的广谱疫苗。
HPV是一种广泛分布的病毒，目前只有相当有限的HPV感染和CIN患者使用疫苗治疗[27]，我们期待着HPV疫苗能够早日应用于临床。
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