引物探针试剂稀释说明及方法

第 1 页 共 5 页 转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书

转基因植物NOS基因核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书

试剂盒简介货为了适应新加坡石斑鱼虹彩病毒染料法荧光定量PCR试剂盒快速检测和疫病研究的需要，本公司参照 OIE国际标准中规定的引物序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。

试剂盒组成及试剂配制：

酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。

2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。

3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶

4.生物su标记抗体稀释液（Biotinantibody Diluent）：1×10ml/瓶。

5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRPavidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.生物su标记抗体（Biotinantibody）：1×120μl/瓶（1：100）

7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRPavidin）：1×120μl/瓶（1：100）

8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 第 2 页 共 5 页 10.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

样本处理及要求：

1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2

8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

研究用

Code No. RR390Q

说明书

Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)

v202203Da 目 录

内 容 页 码 ● 制品说明 1 ● 试剂盒原理 1 ● 制品内容 2 ● 试剂盒外必备主要试剂和仪器 2 ● 保 存 3 ● 使用注意 3 ● 操作方法 3 ● 关联产品 12 ● 制品说明 本制品是采用探针法进行Real Time PCR（qPCR）反应的专用试剂，可用于快速PCR。Premix Ex Taq是一种2X 浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。Mix中添加了Tli RNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以很好地抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。制品中使用了添加了抗体的Hot Start PCR酶TaKaRa Ex Taq HS，与Takara精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。 本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。 特长 1． 适用于Real Time PCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2． 是一种Premix Type试剂，操作简单方便。 3． DNA聚合酶使用了TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与Takara特别开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率、高扩增灵敏度之特点。 4． 在2X 浓度的Premix中，预先添加了耐热性RNaseH（Tli RNaseH），可以很好地抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。 适用的Real Time PCR扩增仪 Thermal Cycler Dice™ Real Time System III（Code No. TP950/TP970/TP980/TP990） Thermal Cycler Dice Real Time System II（Code No. TP900/TP960：终卖） Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Code No. TP700/TP760：终卖) Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System and StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) Smart Cycler System/Smart Cycler II System (Cepheid) ● 试剂盒原理 本制品利用TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增反应，通过使用 Probe对PCR扩增荧光信号强度进行检测。 1. PCR PCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作 用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。 本制品中的DNA聚合酶由于使用了Hot Start PCR酶TaKaRa Ex Taq HS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。 2. 荧光检出 使用5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA等）修饰的寡核苷酸进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，

PCR荧光探针法试剂指导原则如下：

1. 试剂准备：在试剂准备阶段，需要确保所有的试剂都是高质量的，并且在使用前已经正确地储存和复温。所有的PCR反应都需要一个模板DNA，一个引物对，一个DNA聚合酶，以及dNTPs。

2. 反应条件：PCR荧光探针法的反应条件包括预变性、变性、退火和延伸等步骤。这些步骤的温度和时间设置需要根据具体的反应体系和引物设计进行调整。

3. 荧光探针：荧光探针是一种标记有荧光基团的寡核苷酸片段，用于在PCR反应中实时监测扩增产物的生成。荧光探针的长度一般在15-30个核苷酸之间，其序列与PCR扩增的特异性序列互补。

4. 数据分析：在PCR荧光探针法中，数据收集和分析是非常重要的。荧光信号的变化可以实时反映PCR反应的进程，通过记录荧光信号的强度和变化趋势，可以得出扩增曲线和Ct值等数据。这些数据可以帮助判断PCR反应是否成功，以及扩增产物的大小和数量。

5. 质量控制：质量控制是PCR荧光探针法的关键环节之一。通过设置阴性对照和阳性对照，可以判断PCR反应是否正常进行，以及扩增产物是否为目标片段。同时，还需要对实验数据进行统计分析和质量控制评估，以确保结果的准确性和可靠性。

遵循这些指导原则可以帮助研究人员更好地进行PCR荧光探针法实验，获得可靠的结果。

BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, Low ROX)

产品编号 产品名称 包装

D7272-1ml BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, Low ROX) 1ml

D7272-5ml BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, Low ROX) 5ml

D7272-25ml BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, Low ROX) 25ml

产品简介：

 碧云天的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, Low ROX)是一种基于TaqMan等探针的用于实时荧光定量PCR，即探针法qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品质预混液，主要用于cDNA和基因组DNA等的特异性超高灵敏度定量检测。由

于使用的探针一般是TaqMan探针，所以本方法也常称作TaqMan探针法。

 本产品特别适合用于低丰度或高特异性的目的基因的定量或定性检测。例如一些低丰度的mRNA、lncRNA、小RNA、微生物RNA反转录后的高灵敏度检测，一些相似度较高的常规染料法难以区分的同源基因或者基因的SNP检测。

 检测原理：探针法qPCR不使用荧光染料如SYBR Green等对PCR产物进行荧光染色，而是采用了荧光基团和淬灭基团(quencher)标记的DNA探针靶向拟通过PCR检测的目标序列(设计的探针结合位点通常位于两条引物结合位点之间)。正常情况

下，探针上的淬灭基团由于空间上的荧光共振能力转移(FRET)而导致荧光基团淬灭。在PCR反应扩增目标序列时，引物和探针

都会退火到目标基因上，随着引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性会导致结合在目标序列上的探针从5’端开始逐渐被降解。探针的荧光基团和淬灭基团被Taq酶切开后，淬灭基团的作用消失，荧光基团就能正常地被激发光所激发而产生荧光了。每经过