U6_5S_miRNA 引物探针设计

miRNA引物设计方法
一、简介
miRNA引物设计技术是一种用于识别miRNA的分子技术。

miRNA，即microRNA，是一种小RNA分子，可以在细胞表达中作为调控因子发挥作用，因此通过它可以进一步深入研究RNA的功能。

miRNA引物设计技术通过分
析和选择最优的miRNA结合位点来为miRNA定位开发引物，从而对miRNA
的转录进行检测和识别。

1、miRNA数据库
首先，需要建立miRNA数据库，它可以对miRNA的结构和功能进行系
统分析，因此，需要使用一些关键字miRNA的信息，以便以后建立miRNA
的引物库。

同时，还可以了解每个miRNA的表达水平，以便确定miRNA引
物的结构和位点选择。

2、miRNA位点的分析
需要使用相应的软件，如In Silico PCR等，进行miRNA位点的分析，分析结果可以显示miRNA序列的结构特征，以及位点的位置，进而为后续
设计miRNA引物提供必要的信息。

3、miRNA引物的设计
在设计miRNA引物时，需要考虑miRNA引物的链长度、热稳定性和结
合特异性等因素，推荐使用miR primer 3等软件进行miRNA引物的设计，可以比较简便地设计miRNA的引物。

4、miRNA引物的验证
使用miRNA引物进行实验，需要确保其质量，验证的方法有基因芯片验证、PCR产物验证、荧光定量PCR验证等，以确保miRNA引物的准确性和特异性。

三、总结。

microRNA反转和定量引物设计microRNA（miRNA）是一类长度约为18-25个核苷酸的小分子非编码RNA，它们能够通过与靶向mRNA配对而引起转录后基因沉默、翻译后调控等作用。

miRNA在生物体内广泛存在，对于肿瘤发生和发展、免疫应答、细胞分化等生物学过程起着重要作用。

首先，让我们来了解一下miRNA反转的原理。

miRNA反转是将miRNA通过逆转录酶酶（Reverse Transcriptase）转录成DNA的过程。

反转录过程中需要两个基本核酸片段：miRNA的反向亚基（RT primer）和反转录引物（RT primer）。

RT基质是由具有未匹配的末端，可以与miRNA互补配对的引物分子。

反转录过程通过与RT引物的匹配，引发RNA链延长的启动，使得miRNA转录成DNA。

这个反应需要RNA酶H（RNase H）的参与来降解RNA模板。

最终通过PCR扩增获得足够的DNA产物用于后续实验。

然后，我们来了解一下miRNA定量引物设计的步骤。

miRNA定量引物设计主要包括两个部分：上游引物和下游引物。

上游引物被设计成能够特异性结合到miRNA的3’端，而下游引物结合到miRNA的5’端。

这样，当PCR扩增时，上下游引物与miRNA的结合使得DNA在目标区域扩增。

设计定量引物需要考虑以下几个因素：1.引物的长度：通常上游引物长度为19-25个核苷酸，下游引物长度为18-22个核苷酸。

引物长度的选择应遵循引物结合的特异性和扩增效率。

2. 引物的Tm值：Tm值是引物与模板的熔解温度。

建议设计上游引物和下游引物的Tm值在55-65℃之间，以提高引物与miRNA的结合特异性。

3. 引物的序列特异性：为了确保引物能够特异性地结合于目标miRNA，应尽量避免引物与其他miRNA或基因组的序列匹配。

4. 引物的其他特性：引物的GC含量、自身二聚体形成和hairpin结构等也需要考虑。

在设计引物时，可以借助一些在线工具和软件，如Primer3、miRprimer和OligoAnalyzer等，这些工具可以帮助用户进行引物设计和评估引物的特性、特异性和二聚体形成等。

microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明）的内容能够给您的工作和学习带来便利。

同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。

本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为microRNA(miRNA)引物设计及过程原理说明的全部内容。

microRNA(miRNA）引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程,以帮助大家对各方面的学习。

首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。

我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。

打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…;粘贴颈环序列；点击OK。

颈环结构已经输入,下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。

选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。

第一个发夹结构是实验所需的结构（dG=—20.4kc/m).下面结合has—miR—122—5P合成cDNA的具体过程讲解has—miR-122—5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTmiRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构.(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授）has—miR-122-5P的后6位：GTTTGThas-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC颈环引物序列：5’—GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’查看形成的发夹结构（方法前面有讲)看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：在含反转录酶及适当的条件下,miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCA CACTCCA查看cDNA结构：我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA 的反转录过程。

microRNA茎环法引物设计及过程原理说明微RNA (miRNA) 是一类短RNA分子，主要通过抑制靶基因的转录或翻译来调控基因表达。

茎环法是一种常用的方法，用于设计合成miRNA分子的引物。

miRNA的茎环法引物设计过程包括以下几个步骤：1. 确定目标miRNA序列：首先，需要确定要合成的目标miRNA分子的序列。

这通常可以通过测定和分析细胞中的miRNA表达来获得。

2. 寻找互补序列：在茎环法中，引物包括一个5'端和一个3'端，两端分别与miRNA分子的5'端和3'端互补。

因此，需要在目标miRNA序列中找到一个互补的片段，作为引物的5'端。

3.添加限制性酶切位点：在引物的5'端添加一个限制性酶切位点，以便在后续的实验中方便检测和克隆。

4.茎环结构设计：在引物的3'端设计一个茎环结构。

这通常涉及到在互补序列的两端添加一些碱基，以形成一个稳定的结构。

茎环结构的设计旨在增加引物的稳定性和特异性。

5.引物合成与纯化：设计好的引物可以通过化学合成的方法进行合成。

在引物合成过程中，可以添加适当的保护基团，以避免引物和其他非目标序列的交叉反应。

合成后的引物通常需要经过纯化，以去除杂质和未反应的试剂。

6. 引物验证：合成和纯化后的引物需要进行验证，以确保其与目标miRNA分子的特异性。

常见的验证方法包括原位杂交、荧光探针或靶基因表达的检测等。

茎环法引物设计的原理是基于miRNA与其靶基因的互补配对机制。

miRNA通过与靶基因的mRNA片段互补配对形成复合物，并通过不同的机制抑制靶基因的表达。

由于miRNA分子的长度相对较短，使用整个miRNA分子作为引物可能存在对非目标序列的互补配对，导致特异性降低。

因此，在引物设计中，通过选择与目标miRNA互补的片段，并添加茎环结构，可以提高引物的特异性和稳定性。

另外，茎环法引物设计还需要考虑引物的位置和长度。

microRNA茎环引物设计microRNA（miRNA）是一类由约22个核苷酸组成的小分子RNA，可以在细胞内发挥重要的调节作用。

miRNA通过与靶基因mRNA的互补配对，抑制或降解其目标mRNA，从而调控基因表达。

miRNA的表达水平与许多生物学过程密切相关，包括细胞增殖、分化、凋亡等。

因此，在研究miRNA功能和机制、以及在临床上对miRNA进行检测和干预时，对miRNA的茎环引物进行设计具有重要意义。

miRNA的设计要考虑到两个关键因素：miRNA的序列和其结构。

在miRNA的设计中，通常首先要确认目标miRNA的序列，并考虑到与所需过程相关的miRNA。

例如，如果研究中关注其中一种疾病的miRNA调控，那么需要选择与该疾病相关的miRNA作为研究对象。

选择目标miRNA之后，可以利用计算机软件对其进行预测和分析，找出与之互补的茎环引物序列。

miRNA的茎环引物设计的主要目的是使其能够特异性地与目标miRNA结合，形成稳定的RNA-RNA复合体。

这样可以确保引物能够特异性地识别和抑制目标miRNA，并且能够抵抗给miRNA结构造成的严格限制。

同时，茎环引物的设计还应考虑到引物本身的稳定性和理化性质。

设计miRNA茎环引物的关键是使其与目标miRNA的互补序列能够形成稳定的双链结构。

互补序列的长度应该足够长，以确保引物能够牢固地结合在目标miRNA上，但同时不能太长，以免引物与其他非目标miRNA产生互补配对，造成误差。

此外，引物的GC含量应该在45%左右，以提高引物与目标miRNA的互补性和稳定性。

在miRNA茎环引物设计过程中，还应避免引物与其他RNA或DNA分子的非特异性结合。

为了实现这一点，可以通过引入特殊化学基团或修饰物，如磷酸酯修饰、2'-O甲基修饰等，来提高引物的特异性。

此外，在引物设计中还应考虑引物的长度、序列和稳定性等因素，以得到更好的特异性和稳定性。

总之，miRNA茎环引物的设计是研究miRNA功能和机制、以及在临床上对miRNA进行检测和干预的重要一环。

microRNA正向引物设计及实验操作一、原理：二、设计过程:已拥有引物：茎环引物（红）、逆向引物（紫）详细过程：1、安装Primer5.0（软件中的复制只能Ctrl+C）2、File—new—DNA sequence，在空白框中输入A（图1）（图1）3、复制要设计的microRNA（let7b：tgaggtagtaggttgtgtggtt），跳出一个选择框，选择Reverse Complemented（图2）（图3）4、在输入的序列后输入几个G，为正链（橙）5’端突出的互补链（图4）5、点击Primer，跳出图5（图5）6、选择Edit Primers，跳出图6（图6）7、删去空白框中的引物，键盘输入Ctrl+C（即复制要设计的microRNA 序列），在跳出的对话框中选择Reversed，随即在False Priming框下出现红色的Found，点击Found，再点击对话框靠右的Primer，出现图7图7 8、在出现的空白框中调节引物的长度和Tm温度：长度通过删除3’端的碱基控制在15-18个，但其Tm值不得少于35度；Tm温度通过5’端加入G或C来调节，尽量控制在56-59度。

9、调节好后的引物点击对话框中的Analyze，分析修改后的引物。

尽量避免引物二聚体（dimer）的3’端的互补。

10、将修改好的引物复制到目标文档中时，注意引物的方向，一般默认为5’端在前，3’端在后。

三、实验操作1、引物原液稀释：（1）拿到引物原液后，先点离，将引物管中的干粉贴到管壁上。

（2）加入相当于引物管中的nmol值的10倍的水（ddH2O或去离子水），例如nmol=24.456，则加入245ul的水。

（3）在引物管上标记引物的名称和稀释后的浓度，按以上方法稀释后的浓度为100umol。

（4）将稀释好的引物储存液混匀，放置一个上午或颠倒混匀一个小时，再将储存液稀释100倍到1umol，即取1ul的储存液加入到99ul 的ddH2O或去离子水中，并做好引物的标记。

引物探针设计简介已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。

所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。

好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。

引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。

当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。

计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。

一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。

计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。

通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。

因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。

需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。

2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

特异性是指发生错误引发的频率。

特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。

①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。

如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。

百奥迈科生物技术有限公司B 电话：地址：江苏省南通市经济与技术开发区常兴路miRNA Q-PCR Detection Primer Setz 概述：microRNA(miRNA)是一类有大约22 个核苷酸组成的非编码小分子RNA ，其广泛存在于真核生物中。

miRNA 在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。

迄今为此，对miRNA 的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA 的用量较大。

miRNA Q-PCR Detection Kit 采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR 技术来对miRNA 进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。

z 实验原理：z 产品内容：ID Description Qty. RT Primer miRNA Reverse Transcription Primer 2 nmolForward Primer miRNA Forward Primer 2 nmolReverse Primer Universal Reverse Primer 2 nmolz 注意事项：引物为干粉形式，需先离心，后每管加入200 μL Nuclease-Free H 2O 稀释至10μM ，混匀后于-20o C 冻存备用；干粉形式引物可在室温下稳定保存1年。

稀释后溶液在-20o C ，避免在4o C 或室温长期存放；稀释后的溶液可先分装成小份冻存，避免多次反复冻融。

miRNA Q-PCR Detection Primer SetFor the detection and quantification of miRNA using real-time PCR.Catalog No.BK1010一、组成和储存：miRNA 定量检测引物包括以下组分，产品应在-20℃储存，避免在4℃或室温长期存放。

microrna引物设计方法
miRNA引物设计是一种用于特定miRNA的PCR扩增的方法。

以下是一些miRNA引物设计的方法：
1. 基于序列同源性：该方法依据miRNA的序列同源性进行设计引物，即在miRNA序列中选择一小段高度保守的区域，并为该区域设计引物。

2. 基于互补性和mfold分析：该方法基于miRNA的互补性和稳定性进行设计引物。

通常，对于每个miRNA，在其5'和3'端分别设计2对引物，并通过mfold 软件预测引物结构和互补性，选择最适合的引物。

3. 基于基因组的位置：该方法首先在miRNA序列中找到相应的基因组位置，并分析它周围的DNA序列，以确定最佳的引物位置。

这种方法的优点是可以避免短读或多倍体问题。

4. 基于组合算法：该方法利用组合算法，计算miRNA序列中所有可能的引物序列。

然后，通过设计引物的各项指标，如长度、稳定性和互补性等，筛选最佳的引物序列。

通过以上的方法，可以设计出高效、可靠的miRNA引物，以用于qPCR和其他分子生物学分析。

MiRNA引物设计范例MiRNA是一类重要的非编码RNA分子，通过与靶基因的mRNA相互作用，参与调控基因表达。

由于MiRNA在基因调控中的广泛参与，研究其功能已经成为生物学研究的热点之一、而MiRNA引物设计是MiRNA功能研究中关键的一步，它直接决定引物是否具有高效特异性的结合和介导靶基因表达调控的能力。

下面将介绍MiRNA引物设计的范例。

第一步是收集目标MiRNA的序列信息。

可以通过公共数据库（如miRBase）或文献报道中的已知MiRNA序列获取目标MiRNA的序列信息。

收集到的MiRNA序列具有重要的参考价值，可以帮助我们选择合适的引物设计策略。

第二步是选择合适的引物设计策略。

常用的MiRNA引物设计策略包括基于主导一级结构、基于次级结构和基于保守序列的引物设计策略。

根据具体的实验设计和预期的研究结果，可以选择相应的引物设计策略。

基于主导一级结构的引物设计策略是根据MiRNA序列中的主导一级结构特征，选择亲和力更高的引物。

在这种策略中，引物的选择基于与目标MiRNA互补碱基对的特定位置上。

一般来说，在靶基因表达调控中，MiRNA与目标mRNA的互补序列在MiRNA的第2到第8个碱基之间（称为seed区域）非常重要。

因此，主导一级结构的引物设计策略中，通常选择与seed区域互补的引物。

基于次级结构的引物设计策略是根据MiRNA序列的次级结构特征，选择亲和力更高的引物。

MiRNA通过形成伪结和环结构来保持稳定。

因此，基于次级结构的引物设计策略中，一般选择那些可以与MiRNA次级结构特定区域互补碱基对的引物。

基于保守序列的引物设计策略是根据MiRNA序列的保守性特征，选择亲和力更高的引物。

MiRNA作为重要的调控因子，其序列在物种间具有高度保守性。

因此，选择可以针对多个物种特异性MiRNA同时作用的引物，可以在不同物种中进行MiRNA的研究。

第三步是使用计算工具进行引物设计。

在以上选择了合适的引物设计策略后，可以使用相关的计算工具进行引物设计。

学习microRNA的引物设计以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，UggagugugacaaugguguuugTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG GGTGTTTG CAAACACC在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为RT用5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC -3，CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG CAAACACC正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：S端pcr使用5，-ACACTCCAGCTGGG GTCCAGTTTTCCCAGGA -3，ACACTCCAGCTGGG TGGAGTGTGACAATGG在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCGU6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT使用方法：1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物）推荐退火温度：60℃hsa-miR-124 扩增曲线示意图hsa-miR-124 融解曲线示意图3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)推荐退火温度：60℃hsa-miR-125b 扩增曲线示意图hsa-miR-125b 融解曲线示意图4．hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)推荐退火温度：60℃hsa-miR-137 扩增曲线示意图hsa-miR-137 融解曲线示意图5．hsnRNA U6 引物测试推荐退火温度：60℃hsnRNA U6 扩增曲线示意图hsnRNA U6 融解曲线示意图6. 电泳结果取5μl PCR 产物进行电泳,胶浓度（3％）,所有检测都为两个阳性,一个NTC其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6[img]。

教你设计miRNA引物近年来测序很火，很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作，miRNA研究越来越火，然而，找公司设计引物合成引物真心贵（对于我们穷屌丝来说……）。

本人自己动手琢磨了会，哎哟喂~效果良好！好了不闲扯了，下面给大家分享一下我的方法。

miRNA引物设计（茎环法）原理：由于miRNA在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。

具体操作：需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长miRNA的）、实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。

1逆转录引物逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。

“特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。

”5’端茎环结构通常固定，如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ；3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。

即：逆转录引物为“5‘-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’（N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基）。

通俗地说就是，固定的颈环序列（网上很多或者用我这个也行）+miRNA末端6-8个反向互补碱基。

以mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG) 颈环序列+末尾 8个碱基反向互补。

即为：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata[size=13.3333330154419px]2实时定量PCR上游引物上游引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。

手把手教你miRNA研究套路及引物设计方法前面我们讲述了miRNA的生成过程，以及常用预测靶基因数据库。

对于miRNA的研究，相对来说比较简单，可以称得上“投资小，回报快”。

通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA 并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前 miRNA 研究的重要方向。

下面我们就简单讲一下miRNA的研究方法，可以分为以下几个方面：①miRNA芯片:利用miRNA 芯片，可以高通量分析不同肿瘤样本或者不同组织中miRNA的差异表达，对靶基因进行分析，及发育变化中的作用。

②过表达和封闭:通常基因功能研究常常采用过表达、干扰、敲除等方法。

研究miRNA的功能也不例外。

通过导入化学合成的小分子miRNA mimics（mirRNA的成熟体），或者构建mirRNA过表达载体，实现过表达特定mirRNA的目的。

通过构建抑制miRNA的inhibitor，实现抑制特定mirRNA功能的目的。

观察靶基因mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA 功能研究的常用方法。

③双萤光素酶报告系统:通过生物信息学分析获得miRNA的靶基因及相应的结合位点是功能研究的关键内容。

将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR 序列克隆入商品化的双萤光素酶报告载体中，通过检测荧光素酶报告系统发光的强弱，对miRNA以及靶基因结合位点进行体外功能验证。

④QPCR 验证：可以用来检测miRNA 以及其靶mRNA 和相关mRNA 等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。

前者针对特定miRNA 设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。

对于miRNA芯片或者miRNA mimics/inhibitor等，一般可以选择从公司购买。

对于QPCR 验证，涉及到的主要是miRNA的引物设计，而miRNA的引物设计方法与常规引物设计方法不同。

下面就详细讲解一下miRNA的荧光定量PCR引物设计方法-茎环法。

mirRNA引物设计2miRNA常用实验方法；一、miRNA的检测方法；miRNA的realtime-PCR检测方法；1、realtime-PCR引物设计；miRNArealtime-PCR引物设计方法：；1）stem-loopRT引物设计：基于通用的茎；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物设计：miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA 常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的realtime-PCR检测方法1、realtime-PCR引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRN A3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATA CAT 2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm 值接近60度。

因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。

一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。

microRNA_引物设计引言：microRNA是一类长度为21-25个核苷酸的小分子RNA，通过与靶mRNA结合，从而调控靶基因的表达。

microRNA的研究对于理解基因调控网络的功能和异常相关疾病的发生具有重要意义。

在研究microRNA功能和应用的过程中，引物设计是至关重要的步骤之一一、microRNA引物的特征1.引物长度：一般为18-24个核苷酸，确定引物长度要考虑到引物和目标mRNA的互补区域。

2.引物所在位置：应选择在microRNA序列的保守区域，以确保引物的特异性。

3.引物的GC含量：引物的GC含量最好在30%-60%之间，过高或过低的GC含量都会降低引物的特异性。

4.引物的Tm值：引物的Tm值应在50-75°C之间，以保证PCR反应的稳定性。

5.引物的3'端稳定性：引物的3'端最好是G或G/C碱基，以增加引物与靶mRNA的互补稳定性。

6.避免引物之间的重复：将已有的引物序列进行BLAST比对，避免引物之间的重复。

二、microRNA引物设计的步骤1.获取microRNA序列：可以通过数据库（如miRBase）查询或测序分析等方法获取所需的microRNA序列。

2.引物长度的确定：根据目的和实验需求，确定引物的长度，一般为18-24个核苷酸。

3.引物所在位置的选择：通过比对多个物种的microRNA序列，找到保守区域作为引物的设计区域。

4.计算引物的Tm值：根据引物长度、碱基组成等参数，计算引物的Tm值。

常用的公式有Wallace等提出的公式和Breslauer等提出的公式。

5.检查引物的互补性：使用工具（如UCSC Genome Browser或BLAST）检查引物与靶mRNA之间的互补性。

6.检查引物的特异性：使用工具（如miRWalk、miRTarBase等数据库）检查引物与其他非目标mRNA的互补性，以确保引物的特异性。

7.优化引物设计：根据实验需求和前期实验结果，对引物设计进行调整和优化。

专利名称：一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：王频艺,丁平慧,纪博知,郭俊,周榕,刘佳,戴立忠
申请号：CN202111357909.9
申请日：20211116
公开号：CN114085893A
公开日：
20220225
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于miRNA检测领域，更具体地，涉及miRNA 的一步法检测。

本发明提供了一种miRNA检测的引物和探针设计方法，包括该引物和探针设计方法设计的引物和探针的检测组合物，包括该检测组合物的检测试剂盒。

使用本发明方法设计的引物和探针，能够使得miRNA的检测可以采用一步法进行，不会出现非特异性扩增，并且其灵敏度高，达到1000拷贝/mL，特异性好。

操作更加简单、安全，结果更为可信。

申请人：圣湘生物科技股份有限公司
地址：410205 湖南省长沙市高新技术产业开发区麓松路680路
国籍：CN
代理机构：北京派特恩知识产权代理有限公司
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