real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价

taqman探针原理TaqMan探针原理。

TaqMan探针是一种用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）的探针，它以其高度特异性和灵敏度而闻名。

在实时PCR中，TaqMan探针可以用来检测和定量特定DNA序列的存在，因此在分子生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用。

TaqMan探针的原理基于PCR技术，PCR是一种能够扩增特定DNA片段的方法。

在PCR过程中，DNA片段会被不断复制，从而使得起始数量极少的DNA片段得以扩增至足够数量，以便进行后续的分析。

而TaqMan探针则在PCR的基础上，增加了一种荧光信号检测的方法，使得扩增过程可以实时监测和定量。

TaqMan探针由三部分组成，引物（primers）、探针（probe）和荧光染料。

引物是用于引导PCR反应的两个短的DNA片段，它们会结合到目标DNA序列的两端，并作为PCR反应的起始点。

探针是一段含有荧光标记和荧光信号猝灭子（quencher）的DNA片段，它设计为与目标DNA序列的中间部分互补。

在探针未被降解之前，荧光信号被猝灭子吸收，因此不会被探测到。

当PCR反应进行到一定程度时，引物会引导DNA聚合酶复制探针所在的DNA序列，当DNA聚合酶到达探针时，会降解探针，使得荧光信号被释放出来。

荧光信号的强度与PCR反应中目标DNA的数量成正比，因此可以用来实时监测PCR反应的进程。

TaqMan探针的设计需要考虑到多个因素，包括探针的长度、引物和探针的互补性、探针的荧光标记和猝灭子的选择等。

合理的探针设计可以提高PCR反应的特异性和灵敏度，因此在实际应用中需要进行严格的设计和验证。

总的来说，TaqMan探针原理是基于PCR技术的实时荧光定量PCR方法。

通过引物和探针的设计，以及荧光信号的监测，TaqMan探针可以实现对特定DNA序列的快速、特异性和定量检测。

在分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域，TaqMan探针都发挥着重要的作用，为科学研究和医学应用提供了强大的工具。

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。

荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。

目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。

广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。

当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。

也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

(请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。

常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。

当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。

荧光定量PCR实验指南来源：易生物实验浏览次数：901网友评论0 条荧光定量PCR实验指南关键词：荧光实验指南第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。

下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。

保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。

另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。

然后要对所有的序列进行排序。

用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“adda ll”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。

横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。

有时要设定比较序列的开始与结尾。

有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。

再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。

taqman探针原理
Taqman探针是一种基于荧光的实时聚合酶链反应（real-time PCR）技术中常用的探针。

它通过结合于扩增DNA序列的内部区域并在聚合酶链反应过程中进行降解来测量DNA扩增的数量。

Taqman探针主要由一个与目标DNA序列互补的引物和一个含有荧光染料和淬灭染料的荧光探针构成。

在PCR反应开始时，聚合酶链反应体系中存在的引物和Taq DNA聚合酶开始扩增DNA的目标序列。

同时，Taqman探针也与目标序列的内部互补区域结合。

这个内部区域一般位于引物之间，并且特异性地结合于目标序列上。

在DNA扩增的过程中，Taq DNA聚合酶逐渐移动，并且在目标序列的内部区域进行脱氧核苷酸的合成。

这导致Taqman探针在聚合酶链反应的过程中被切割，并将荧光染料和淬灭染料分离开来。

在扩增过程中，荧光染料被释放出来，并且可以被特定荧光探针识别和检测。

一旦有荧光信号的释放，荧光探针就会与其结合，产生荧光信号的峰值。

这使得实时PCR仪器可以测量DNA扩增的数量，从而确定初始样本中目标DNA的量。

Taqman探针的优势在于其高特异性和灵敏度。

由于荧光探针是特异性地与目标序列结合，可以避免假阳性信号的产生。

此外，实时PCR技术可以在PCR反应过程中进行数据收集，使得结果可以实时监测和分析。

总而言之，Taqman探针是一种基于荧光的实时PCR技术中常
用的探针，通过结合于目标序列的内部区域并在PCR反应过
程中降解来测量DNA扩增的数量。

它具有高特异性和灵敏度，并且可以实时监测和分析扩增过程。

real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。

即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。

当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。

但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。

这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。

两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。

若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。

另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。

二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。

理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。

若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。

且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。

且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。

2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。

Taqman设计总结⼀、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实⼀次）1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前①长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。

② TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃），最好为70℃，确保探针的Tm值要⽐引物的Tm值⾼出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守⽚段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。

③探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp（⼀般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。

④5'端应避免使⽤碱基G，5' G会有淬灭作⽤，即使被切割下来这种淬灭作⽤也还会存在；如果选择FAM-dye在5'端第⼆个序列也不能为G（G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal）。

⑤可选：整条探针中，碱基C的含量要明显⾼于G的含量，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另⼀条链作为探针。

要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。

若找不到完全保守的⽚段，也只能选取有⼀个碱基不同的⽚段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。

⑥Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同⼀碱基重复过多，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe.Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in themiddle of the probe, which can sometimes reduce signal）。