引物探针设计原则

引物探针设计原则

张远涛Ph.D.

Sr Field Application Scientist Hotline: 800 820 8982

cnmcbsupport@

定量PCR开发流程

选择目标基因/ SNP位点

设计探针和引物

筛选引物、探针，优化各组分浓度

验证

完成

选择目的基因/SNP位点

序列查找

引物探针设计

两种实验设计策略

•正向策略

–修改反应条件

–适应PCR引物•反向策略

–设计引物适应反应条件

–确定标准的化学

–确定标准的程序

–设计标准的扩增产物

探针设计指南

•先设计探针，后设计引物

•探针的5'端第一个碱基不能是G

•基因表达探针Tm值：68-70°C；基因分型探针Tm值：65-67°C •TaqMan-MGB探针长度在13-25bp，TaqMan探针长度13-30bp •避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G

•C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链

•多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基

为什么要C比G多？

反义链：11 C / 3 G

正义链：3 C / 11 G

NN N N N N N N N N N N N N N N N N N

polymorphism

Try to position the polymorphism here (central third)If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)

DO NOT

PLACE HERE

基因多态位点探针中的位置

基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性

3'

R

Q TaqMan 探针

Exon 1Exon 3

Exon 2用于基因表达的探针设计

报告荧光(7500)

~670CY-5报告荧光(7500)~610TEXAS Red

参比荧光~610ROX

报告荧光(7500)~580CY-3

报告荧光~580NED

淬灭荧光~580TAMRA

报告荧光~550VIC

报告荧光~550JOE

报告荧光~520SYBR Green I

报告荧光~5206-FAM

用途最大发射峰(nm)荧光染料

荧光标记基团的选择

引物设计指南

•引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠

•引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间•避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G •引物Tm值在58-60°C之间，上下游引物Tm不要超过2°C •引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个•引物3’端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基•避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对•避免引物自身形成环状发卡结构

•扩增片段的长度在50-150bp间

primer

template

polymerisation 3'

5'

为什么要减少引物3’端的G和C？

引物3’端过多的G、C会导致暂时性错误复性，并很快就会被DNA酶稳定下来

Primer Express v3.0软件

引物探针设计常用工具

设计软件：Primer Express、Beacon Desinger、Primer5

网络免费资源：/

/realtimedesign

/

MFold（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html）•引物和扩增产物二级结构的预测

•二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度(T m)

NCBI

•BLAST扩增特异性

•/Blast.cgi

反应试剂优化

mM

3.5~10MgCl 2U/μl 0.03~0.05Taq

mM 0.15~0.20dUTP

mM 0.15~0.20dCTP

mM 0.15~0.20dGTP

mM 0.15~0.20dATP

μM 0.15~0.20探针3

μM 0.20~0.30引物2

μM 0.20~0.30 引物1

mM 50~100KCl

mM 10~50Tris-HCl（pH 8.3 ）

反应浓度成分

引物浓度优化的数据判定

N

高浓度/高效率

高浓度/低效率

低浓度/高效率

N:产物数量

n:循环数

n

热循环程序

激活Taq

灭活UNG

UNG反应退火延伸检测