诱导成骨分化实验

中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。

通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

通讯作者：王稚英，Email：weisiwei703@hotmail．com。

收稿日期：2011－12－16·短篇论著·富血小板纤维蛋白（PRF）诱导骨髓间质干细胞分化成骨细胞的实验研究魏思维1，王稚英2（辽宁医学院附属第二医院口腔颌面外科，辽宁锦州121000）摘要：目的研究富血小板纤维蛋白在诱导骨髓间质干细胞向成骨细胞转化的作用。

方法取7天新西兰大白兔股骨，分离骨髓间质干细胞进行体外培养，在各自的培养条件下分为三组：实验组（不同剂量的PRF 组）、空白对照组（MSCS组）和阳性对照组（BMP－2组）。

三组细胞的比较采用MTT测定细胞增值率、PNPP法测定碱性磷酸酶的表达、免疫组化标记Ⅰ型胶原蛋白的表达、检测细胞为成骨细胞。

结果细胞形态学观察，MSCS分化后，细胞形态从长梭形变成三角形，多角形，立方形；MTT测定细胞增殖显示，随着PRF膜剂量的增加，细胞增殖数量增加，PRF剂量为4，5mL时，与BMP－2组差别不大；ALP活性结果显示，MSCS分化后，ALP 活性远高于MSCS细胞。

两者差异具有显著统计学意义（t=24．608，p=0．000）；免疫组化标记Ⅰ型胶原结果显示，PRF组分化后的MSCSⅠ型胶原表达显著。

结论富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，分化的类成骨细胞具有成骨细胞的特性，可以作为自体材料应用于口腔种植学领域里骨缺的修复。

关键词：富血小板纤维蛋白（PRF）；骨髓间质干细胞；分化；成骨细胞中图分类号：R331．143文献标识码：BThe study of the function of PRF in the processof inducing MSCs into osteoblastsWEI Si－wei，WANG Zhi－ying（The Second Affiliated Hospital，Liaoning Medical College，Jinzhou，Liaoning121000，P．R．China）Abstract：【Objective】to study the function of PRF in the process of inducing MSCs into osteoblasts．【Meth-ods】isolate MSCs from the femur of7－day－old rabbits and divided into3groups．Experimental group（different does of PRF），control group（MSCs）and positive control group（BMP－2）．Use MTT assay to calcuLate cell prolif-eration rates of each group，use PNPP assay to measure expression of alkaline phosphatase（ALP），and use IHC to de-tect collagen one．【Results】morphological observation shows cells shape change from long spindle into triangle，quad-rangle and polygon after MSCs differentiation．MTT shows cell proliferates as PRF does increases．ALP expression of differentiated MSCs is higher than MSCs（t=24．608，p=0．000）．IHC shows collagen one express significantly in ex-perimental group．【Conclusion】PRF promotes the process of inducing MSCs into osteoblasts．It can be used as autog-enous material in bone repairmen of oral implantology．Key words：platelet－rich fibrin，PRF；mesenchymal stem cell，MSCS；trans－differentiation；osteoblast cells种植领域里常见的临床难题是骨缺损，骨组织工程技术的发展为骨缺损提供了新的途径，骨髓间质干细胞被认为是骨组织工程理想的种子细胞，它可在体外大量扩增并保持成骨潜能。

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。

干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。

在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。

在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。

2. 定向诱导干细胞分化。

3. 成长曲线测定。

4. 诱导分化后细胞鉴定。

5. 结果统计分析。

万方数据甄蕾，等．人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导ＺＨＥＮＬｅｉ．ｅｔａＬＨｕ眦ｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏＯｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ／ｎｖ／ｔｒｏ・３１９・ＲＮＡ提取试剂盒、一步法ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ公司。

北京）。

１．２方法１．２．１牙周膜细胞原代培养收集临床１２一１８岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，ＰＢＳ洗３次，刮取根中ｌ，３牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，每隔３ｄ换液．直至细胞从组织块周围游出。

细胞生长达８０％汇合时传代。

１．２．２有限稀释法克隆化培养纯化ＰＤＬＳＣｓ取对数生长期的第１代细胞。

以１～２个／孔的密度接种于９６孔板，常规培养７。

１４ｄ，至出现细胞克隆（细胞数≥５０为判定标准）后扩大培养。

１．２．３ＰＤＬＳＣｓ的初步鉴定分别取第２代克隆形成细胞进行爬片。

采用ＳＰ法检测波形蛋白和角蛋白的表达。

同时利用兀ＴＣ荧光标记二抗检测ＳＴＲＯ．．１和ＣＤｌ４６的表达。

１．２．４体外诱导分化取第２代对数生长期的克隆形成细胞。

按５ｘｌｌＹ个／ｍＬ接种于２４孔板中，待细胞进入对数生长期后弃去原培养液。

ＰＢＳ洗３遍，换诱导液（１０ｍｍｏｌ／ＬＢ．甘油磷酸钠、１０｛ｍｏｌ／Ｌ地塞米松、５０Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ维生素Ｃ）培养２１ｄ。

对照组细胞常规培养。

１．２．５成骨性能的鉴定１．２．５．１茜素红Ｓ染色观察钙结节形成人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ后饱和茜素红Ｓ溶液染色１０ｍｉｎ，观察钙结节形成情况。

１．２．５．２定性的细胞ＡＬＰ活性检测人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液。

按ＡＬＰ检测试剂盒说明书规范操作。

光学显微镜下观察染色情况。

１－２．５．３免疫细胞化学检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后常规ＳＰ法检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原蛋白表达情况。

１．２．５．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＬＰ、ＢＳＰｍＲＮＡ表达收集诱导培养２１ｄ后的人ＰＤＬＳＣｓ．。

miR-21诱导犬BMSCs骨向分化的体外实验研究王颖;张雷;周咏;张凯;王元银;何家才;邹多宏【摘要】目的体外研究检测miR-21诱导拉布拉多犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用.方法构建LentimiR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体,分别转染犬BMSCs,将研究分为miR-21组与LacZ组.利用体外细胞划痕实验来比较转染后BMSCs的爬行迁移能力.在转染后的第0、1、4、7、14天分别提取miR-21组与LacZ组BM-SCs的mRNAs和蛋白.通过Real time-PCR技术和Westernblot检测成骨分化关键因子骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达.结果 Lenti-miR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体成功转入BMSCs后,miR-21组的BMSCs细胞爬行迁移能力显著增强(P＜0.001);Real time-PCR和Western blot结果显示,miR-21可以显著上调BMSCs成骨分化关键因子OCN和OPN的表达(P＜0.05).结论 miR-21可以显著促进BMSCs的成骨分化,为进一步的体内实验奠定基础.%Objective To explore the effect of miR-21 on the osteogenic differentiation of Labrador dog bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro.Methods Lenti-miR-21-Luciferase and Lenti-LacZ-Luciferase lentiviral vector were constructed and then were transfected into canine BMSCs.The study was divided into miR-21 group and LacZ group.The cell scratch test was used to compare the migration ability of BMSCs after lentiviral vector transfection.The mRNA and protein of BMSCs were extracted on 0,1,4,7,and 14 days.The expression of osteocalcin (OCN) and osteopontin (OPN),the key factors of osteogenic differentiation of BMSCs,were detected by Real time-PCR and Western blot.Results After Lenti-miR-21-Luciferase and Lenti-LacZ-Luciferase weresuccessfully transfected into BMSCs,the migration of BMSCs in miR-21 group was enhanced significantly (P ＜ 0.001).Expression of OCN and OPN at the mRNA and protein levels were significantly increased (P ＜0.05).Conclusion MiR-21 can significantly promote the osteogenic differentiation of BMSCs,lay the foundation for further in vivo experiments.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2017(052)009【总页数】6页(P1318-1323)【关键词】miR-21;骨髓间充质干细胞;慢病毒转染;成骨分化【作者】王颖;张雷;周咏;张凯;王元银;何家才;邹多宏【作者单位】安徽医科大学口腔医学院,合肥230032;安徽医科大学附属口腔医院,安徽省口腔疾病研究中心实验室,合肥230032;安徽医科大学口腔医学院,合肥230032;安徽医科大学附属口腔医院,安徽省口腔疾病研究中心实验室,合肥230032;安徽医科大学口腔医学院,合肥230032;安徽医科大学附属口腔医院,安徽省口腔疾病研究中心实验室,合肥230032;蚌埠医学院第一附属医院口腔科,蚌埠233000;安徽医科大学口腔医学院,合肥230032;安徽医科大学附属口腔医院,安徽省口腔疾病研究中心实验室,合肥230032;安徽医科大学口腔医学院,合肥230032;安徽医科大学附属口腔医院,安徽省口腔疾病研究中心实验室,合肥230032;安徽医科大学口腔医学院,合肥230032;安徽医科大学附属口腔医院,安徽省口腔疾病研究中心实验室,合肥230032【正文语种】中文【中图分类】Q7;R34干细胞治疗是组织再生中发展迅速的领域之一，有强大的组织再生治疗效果[1-2]。

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。

方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。

结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。

成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。

结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。

Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。

成骨诱导培养基配方介绍成骨诱导是一种在体外培养条件下诱导干细胞或间充质干细胞向成骨细胞分化的过程。

成骨诱导培养基是通过提供特定的营养物质和生长因子来模拟体内成骨环境的培养基。

本文将详细讨论成骨诱导培养基的配方及其影响因素。

成骨诱导因子成骨诱导培养基的核心是成骨诱导因子，它们是一类能够促进干细胞或间充质干细胞向成骨细胞分化的信号分子。

以下是一些常见的成骨诱导因子：1.骨形成蛋白（BMPs）2.成骨细胞分化因子（RUNX2）3.碱性磷酸酶（ALP）4.骨基质蛋白（BSP）5.Osterix这些因子在不同阶段的成骨分化中起着关键作用，并能够调控细胞增殖、分化和骨基质合成。

成骨诱导培养基配方成骨诱导培养基的配方是根据不同细胞类型和研究目的来确定的。

下面是一种经常使用的成骨诱导培养基配方：成骨诱导培养基配方（基础版）•DMEM/F12培养基•胚牛血清（FBS）或胎牛血清（FCS）•抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）•1% 非必需氨基酸溶液• 2 mM L-谷氨酰胺（L-Glutamine）•10 mM β-甘油磷酸钠（β-glycerophosphate）•10 nM 二磷酸腺苷（dexamethasone）•0.05 mM 抗坏血酸（ascorbic acid）•成骨诱导因子（根据需求添加）成骨诱导培养基的优化成骨诱导培养基的配方可以根据研究需求进行优化。

以下是一些常见的优化因素：1. 成分浓度调节各种成分的浓度可以根据实验需要进行调节。

例如，增加成骨诱导因子的浓度可以提高成骨分化效果，而降低成骨诱导因子的浓度则可以减缓成骨分化速度。

2. 添加辅助因子除了基本的成骨诱导因子外，还可以添加其他辅助因子来增强成骨效果。

例如，添加维生素D3和维生素K2可以提高骨基质合成和骨矿化。

3. 优化培养时间培养时间对于成骨诱导的效果也有一定影响。

较长的培养时间可以促进细胞进一步分化为成熟的成骨细胞，但可能会降低细胞存活率。