非发酵革兰阴性杆菌
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铜绿假单胞菌生物学特性、实验室检查、生化鉴定、临床症状、耐药性及预防生物学特性铜绿假单胞菌是常见条件致病菌,属于非发酵革兰氏阴性杆菌。
菌体细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。
菌体的一端有单鞭毛,在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
铜绿假单胞菌为专性需氧菌,最适生长温度为25~30℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。
在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素,绿脓素与带荧光的水溶性荧光素等。
在血平板上会有透明溶血环。
含有O抗原以及H抗原。
O抗原包含两种成分:一种是其外膜蛋白,为保护性抗原;另一种是脂多糖,有特异性。
O抗原可用以分型。
实验室检查标本来源。
采自不同感染部位的各种标本,包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。
还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。
染色镜检。
为革兰阴性杆菌,菌体大小(1.5~5.0)um×宽(0.5~1)um,细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。
菌体的一端有单鞭毛,无芽胞,无荚膜。
分离培养本菌生长对营养要求不高。
对有正常菌群存在的临床标本或来自环境中的标本应接种选择性培养基如麦康凯琼脂培养基(MAC);对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通全营养型培养基或血琼脂培养基、铜绿假单胞菌培养基。
普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落,该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色;在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环,菌落呈金属光泽;在铜绿假单胞菌培养基上呈蓝绿色或者红褐色菌落,365nm紫外灯下显荧光。
如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长,在液体表面形成菌落,而在培养基底部的细菌生长不良。
生长实验。
铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长。
生化鉴定分型(1)噬菌体分型:所应用的噬菌体现有24株,分型率达90%。
非发酵菌是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌;多为条件致病菌。
【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性,醋酸钙不动杆菌为阴性【非发酵菌生化编码管鉴定】原理:该系列鉴定共有9种生化培养基,共10项试验,参照下述方法,将试验结果换算成4位数字,加以数值化后查表。
例:某一分离菌株,具有下列鉴定结果,数值化后为1734,查表得知:可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌,再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。
观察结果时按表中说明进行。
一、O-F试验接种2支编码管,1支加无菌石蜡油,另1支不加。
原理:细菌在分解葡萄糖的过程中,必须有分子氧参加的,称为氧化型;能进行无氧降解的为发酵型;不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖,而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。
本试验又称氧化发酵(O/F或Hugh-Leifson,HL)试验,可用于区别细菌的代谢类型。
培养基均不产酸(颜色不变)为阴性;培养基表面和底部都产酸(变黄)为发酵型;培养基表面变为深蓝色为产碱型;培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。
二、硝酸盐还原试验原理:某些细菌能还原培养基中的硝酸盐,生成亚硝酸盐和氮气等。
硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。
如培养基中有亚硝酸盐存在,则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸,亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸,后者与α-萘胺结合成N-α-萘胺偶氮苯磺酸。
假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气,此为脱硝化或脱氮化作用。
结果解释:注意事项:若加入硝酸盐试剂不出现红色,需检查硝酸盐是否已被还原,可于原试管内再加入少许锌粉,如出现红色,表示硝酸盐仍然存在;若不出现红色,表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。
【鞭毛染色】普通染色法一般无法看到鞭毛,要用特殊染色的方法,常采用镀银染色法和鞭毛染色法等,本次实验采用镀银染色法。
方法与原理:在无菌平皿中加10mL左右蒸馏水,用接种环挑一环铜绿假单胞菌,在水面轻轻飘散,可适当研磨,静置10分钟,菌体内部相比蒸馏水为高渗环境,故蒸馏水大量进入菌体,使包括鞭毛在内的菌体胀大,使鞭毛得以被看到。
非发酵菌的鉴定定义:非发酵菌(nonfermenters)指一群需氧或兼性厌氧、不发酵糖类,能在普通培养基上生长的革兰阴性杆菌。
主要存在外界环境中,种类繁多,多为条件致病菌或医院内感染菌。
关于临床标本中NFB的意义,在混合培养物中见到时,必须考虑到患者的情况和标本来源。
一般来说,以纯培养方式分离自正常无菌部位的NFB,一定要鉴定到种并进行抗生素敏感性试验。
目前CLSI中,K-B法除了假单胞菌属、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌有抗生素敏感性实验的判断标准外,其他非发酵菌没有K-B法的标准。
一、鉴定原则:1.血、无菌部位(脑脊液、胸水等),特殊病人,少见菌可用API-20NE或VIKET TWO-GN 卡鉴定。
2.其它部位如呼吸道标本、临床常见的非发酵,根据菌落形态、生化反应、抗生素耐药谱等综合分析手工法鉴定即可。
二、非发酵性菌基本分类:假单胞菌属Pseudomonas spp.(20多个临床上重要菌种中,铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌等最常见。
)不动杆菌属Acinetoacter spp.(最常分离的种鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌、溶血不动杆菌等)窄食单胞菌Stenotrophomonas spp.(嗜麦芽窄食单胞菌、非洲嗜麦芽窄食单胞菌)伯克霍尔德菌Burkholderia spp.(洋葱伯克霍尔德菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等)鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas spp.(少动鞘氨醇杆菌)无色杆菌属Achromobacter spp.(木糖氧化无色杆菌)希瓦氏菌属Shewanella spp. (腐败希瓦氏菌海藻希瓦氏菌)产硷菌属Alcaligenes spp.黄杆菌属Flavoacterium spp.莫拉菌属Moraxella spp.罗尔斯通菌属 Ralstonia spp.食酸菌属Acidovorax spp.丛毛单胞菌属Comamonas spp.甲基杆菌属Methylobacterium spp.等还有一些未定名的菌群三、辨认非发酵菌的基本要点1. 分离培养基上的菌落有以下情况初步考虑非发酵菌的存在a.培养基上生长较差或中国蓝上不生长的阴性菌。