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重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

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第３９卷第６期第７５８页　２０１０年１２月　华中科技大学学报（医学版）　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｖ０ｌ＿３９　Ｎｏ．６　Ｐ．７５８　Ｄｅｃ．　２０１０　

重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥＳ—ＢＤＮＦ的构建及其　

在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达　

张斌青，　安锐△，　吴　涛，　孙逊　＊　

华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，湖北省分子影像重点实验室，武汉４３００２２　

摘要：目的体外构建携带报告基因胸腺嘧啶核苷激酶（ＴＫ）和治疗基因脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）的重组质粒　载体ｐｃＤＮＡ３．１一ＴＫ—ＩＲＥＳ－ＢＤＮＦ，并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）中的表达。方法　采用密度梯度离心法　分离获得ＢＭＳＣｓ，进行细胞免疫化学鉴定；应用ＰＣＲ技术获得ＨＳＶ１一ＴＫ、内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）、ＢＤＮＦ的ｃＤ—　ＮＡ序列，酶切后依次插入到ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点（ＭＳＣ）中，酶切和序列分析鉴定；脂质体介导重组质粒ｐｃＤ—　

ＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥＳ－ＢＤＮＦ转染ＢＭＳＣｓ，ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测其目的基因表达。结果重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—　ＩＲＥＳ－ＢＤＮＦ经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致；ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测证实ＴＫ和ＢＤＮＦ在ＩＲＥＳ介导下　可同时表达。结论　成功构建重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥＳ－ＢＤＮＦ并在ＢＭＳＣｓ中有效表达，为下一步核素活体示踪　

转基因ＢＭＳＣｓ治疗脑血管疾病奠定了实验基础。　关键词：骨髓间充质干细胞；　报告基因；　基因治疗　

中图分类号：Ｒ３４９．６　ＤＯＩ：１０．３８７０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—０７４１．２０１０．０６．００６　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥＳ—ＢＤＮＦ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　

Ｚｈａｎｇ　Ｂｉｎｑｉｎｇ，Ａｎ　Ｒｕｉ△，Ｗｕ　Ｔａｏ　ｅｔ　ａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＴｏｎｇＪｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００２２，Ｃｈｉｎａ　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥ　ＢＤＮＦ，ａｎｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓ　ＴＫ，ＩＲＥＳ　ａｎｄ　ＢＤＮＦ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３．１　ｖｅｃｔｏｒ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ．ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ＢＭＳＣｓ．Ｒｅ－　ｓｕｉｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＫ　ａｎｄ　ＢＤ—　ＮＦ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．ＣｏｎｃＬｕｓｉｏｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｕｋａｒｙｏｔｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３．１一　ＴＫ—ＩＲＥＳ—ＢＤＮＦ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｉｎ　ＢＭＳＣｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ；　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　

转基因干细胞的兴起为脑梗死等难治性疾病带　

来了新的曙光，但目前对转基因干细胞进入活体后　

的动态变化缺乏有效的示踪技术，影响了其进一步　

发展。放射性核素报告基因显像技术是分子影像学　

的重要组成部分，工型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ｈｅｒ—　

ｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｔｙｐｅ一１。　

ＨＳＶ１一ＴＫ）是较常用的酶报告基因，以往的应用主　

要集中于肿瘤基因治疗的示踪＿１］。将报告基因和治　

疗基因偶联后，通过分子生物学技术转入干细胞，即　

可示踪转基因干细胞的动态变化，为活体示踪转基　

国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０７７０６０５）　张斌青，男，１９８１年生，医学博士，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｑｆｚｂｑ＠１　６３．ｃｏｍ　通讯作者，Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ａｎｒｕｉｗｈ＠１６３．ｃｏｍ　因干细胞提供了一种新的无创技术。本研究旨在构　

建携带报告基因ＴＫ和治疗基因脑源性神经营养因　

子（ｂｒａｉｎ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）的真　

核质粒表达载体，培养大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭ—　

ＳＣｓ），检测携带偶联基因的质粒载体对ＢＭＳＣｓ的　

转染和目的基因的表达，为下一步选择合适的载体　

活体示踪转基因干细胞移植治疗脑梗死奠定实验基　

础。　

１材料与方法　

１．１主要材料　

质粒ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ—ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１一　

ＴＫ以及ｐｃＤＮＡ３．卜ＥＧＦＰ均为本实验室保存；逆　张斌青等．重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１＿ＴＫ—ＩＲＥ￣ＢＤＮＦ的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达　・７５９・　

转录酶，限制性内切酶ＢａｍＨ工、Ｘｂａ工、ＥｃｏＲ　Ｉ、　

Ａｆｌ　ＩＩ，高保真Ｐｆｕ　ｕｌｔｒａ　ＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ连接酶　

和ＤＨ５　０【均为ＴａＫａＲａ公司（日本）产品；Ｔｒｉｚｏｌ，胎　

牛血清，Ｌ—ＤＭＥＭ及脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ　２０００为　

Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（美国）产品；质粒抽提试剂盒和　

ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为Ｑｉａｇｅｎ公司（美国）产品；　

其他试剂均为进口或国产化学分析纯。引物合成、　

测序均由上海生工生物工程有限公司完成。ＳＤ大　

鼠来源于华中科技大学同济医学院实验动物学部。　

人淋巴细胞分离液购自天津ＴＢＤ公司。兔抗鼠　

ＣＤ４４、ＣＤ３４、ＢＤＮＦ单克隆抗体，羊抗兔ＩｇＧ／ＨＲＰ　

试剂盒，羊抗鼠Ｂ—ａｃｔｉｎ抗体均购自武汉博士德生物　

工程有限公司。　

１．２　目的基因引物设计与合成　

根据ＧｅｎＢａｎｋ里的ＴＫ、ＩＲＥＳ以及大鼠ＢＤＮＦ　

基因的ＣＤＳ区合成相应的引物，并在引物的两端加　

入与质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点（ＭＳＣ）相　

对应的酶切位点。引物序列、引入的酶切位点（下划　

线）及前面的保护碱基如表１所示。设计好的引物　

送上海生工生物工程有限公司合成。　

表１　目的基因ＰＣＲ引物序列及引入的内切酶　Ｔａｂｌｅ　１　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ　

１．３真核质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１一ＴＫ－ＩＲＥＳ－ＢＤＮＦ的构建　使用以上合成的引物小片段进行ＰＣＲ扩增获　

得各个目的片段，对其两端酶切后依次插入到同时　

进行过相应酶切的ｐｃＤＮＡ３．１载体中，最终得到目　

的质粒命名为ｐｃＤＮＡ３．１＿ＴＫ—ＩＲＥＳ—ＢＤＮＦ。在载　

体构建过程中每插入一个片段都要进行酶切鉴定，　

最终目的质粒送公司测序。　

１．４　ＢＭＳＣｓ原代细胞培养与鉴定　采用密度梯度离心法培养ＢＭＳＣｓ。无菌条件　下取３～４周龄ＳＤ大鼠股骨和胫骨，剪去骨骺端，　

用Ｌ－ＤＭＥＭ培养液冲出骨髓，离心收集细胞，用人　

淋巴细胞分离液分离ＢＭＳＣｓ，将分离得到的ＢＭ—　

ＳＣｓ接种到含有２Ｏ　胎牛血清的Ｌ—ＤＭＥＭ培养液　

中，在３７℃、５　ＣＯ。饱和湿度培养箱中培养。３～５　

ｄ细胞换液，８～１２　ｄ第１次传代，以后３～５　ｄ传代　

１次。检测细胞标志物ＣＤ３４（一）和ＣＤ４４（＋）的表　

达，对细胞进行鉴定。取第２～４代细胞爬片固定，　

依次经过Ｈ　Ｏ。孵育、封闭血清孵育、ＣＤ３４（一）或　

ＣＤ４４（＋）抗体孵育、二抗孵育、苏木精复染之后，显　

微镜下观察照相。　

１．５脂质体介导质粒载体转染ＢＭＳＣｓ　

取２～４代细胞，待细胞生长融合至约８０％后　

进行转染，转染时细胞换无血清培养液，质粒ｐｃＤ—　

ＮＡ３．１－ＥＧＦＰ（／￣ｇ）与脂质体（　Ｌ）按１：２．５转染，４　

～６　ｈ后换液置３７℃，５　ＣＯ。饱和湿度培养箱中培　

养。待质粒转染４８　ｈ后荧光显微镜下观察绿色荧　

光细胞，流式细胞仪检测绿色荧光细胞阳性率。　

１．６　ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＨＳＶ－ＴＫ基因ｍＲＮＡ的转录　

ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥＳ－ＢＤＮＦ转染ＢＭＳＣｓ　４８　ｈ　

后，Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细胞总ＲＮＡ，逆转录得到ｃＤ—　

ＮＡ，ＰＣＲ扩增出目的片段。引物序列见表２。ＰＣＲ　

反应条件：９４℃预变性５　ｒａｉｎ，９４℃解链３０　Ｓ、５７℃退　

火３０　Ｓ、７２℃延伸１　ｒａｉｎ，循环３Ｏ次，７２℃总延伸１Ｏ　

ｒａｉｎ，４￣Ｃ终止反应。取５　Ｌ的ＰＣＲ产物经２　琼　

脂糖凝胶电泳分析结果。　

表２　ＰＣＲ引物序列及扩增片段大小　Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓ　

１．７　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ＢＤＮＦ基因的表达　

ｐｃＤＮＡ３．１－ＴＫ—ＩＲＥＳ—ＢＤＮＦ转染ＢＭＳＣｓ　４８　ｈ　

后，蛋白裂解液充分裂解细胞，沸水浴５　ｍｉｎ，取５０　

Ｌ进行１２　ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转　

移至硝酸纤维素膜上，封闭后加人１：１００抗ＢＤＮＦ　

多克隆抗体，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二　

抗，显色，曝光，显影及定影。

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Smad真核表达质粒构建及其在小鼠T淋巴瘤细胞中的表达

Smad真核表达质粒构建及其在小鼠T淋巴瘤细胞中的表达

山东医药２０１８年第５８卷第２ｌ期　

Ｓｍａｄ真核表达质粒构建及其在小鼠　

Ｔ淋巴瘤细胞中的表达　

王婧帆。季然，李鑫宇，陈金铃　

（南通大学医学院病原生物学系，江苏南通２２６０００）　

摘要：目的构建并鉴定ｐｃＤＮＡ３．１一Ｓｍａｄ２、ｐｃＤＮＡ３．１一Ｓｍａｄ３及ｐｅＤＮＡ３．１一Ｓｍａｄ４真核表达质粒，探讨Ｓｍａｄ在　小鼠Ｔ淋巴瘤细胞（ＥＩＡ）中能否稳定表达。方法以ＥＬ４细胞ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ法获取转录因子Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、　Ｓｍａｄ４　ｍＲＮＡ　ＣＤＳ区即目的基因片段；构建含有目的基因的Ｔ载体ｐＭＤ１９．Ｔ．Ｓｍａｄ２、ｐＭＤ１９一Ｔ—Ｓｍａｄ３、ｐＭＤ１９．Ｔ．　Ｓｍａｄ４；用ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切ｐｅＤＮＡ３．１载体、ｐＭＤ１９一Ｔ—Ｓｍａｄ２，用Ｘｈｏ　Ｉ和ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切ｐｃＤＮＡ３．１载体、　ｐＭＤ１９－Ｔ—Ｓｍａｄ３及ｐＭＤ１９一Ｔ·Ｓｍａｄ４，Ｔ４　ＤＮＡ连接酶连接纯化后的酶切产物；将连接产物转化ＤＨ５ｃ￣大肠杆菌感受　态细胞并挑选阳性克隆，扩大培养并提取重组质粒；通过ＰＣＲ、双酶切及ＤＮＡ测序等方法鉴定重组质粒。将构建　好的ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓｍａｄ２、ｐｃＤＮＡ３．１一Ｓｍａｄ３、ｐｃＤＮＡ　３．１一Ｓｍａｄ４电转入ＥＬ４细胞，７２　ｈ后用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测ＥＬ４　细胞中目的蛋白的表达。结果ＰＣＲ和双酶切结果均提示重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１．Ｓｍａｄ２、ｐｃＤＮＡ３．１．Ｓｍａｄ３、ｐｃＤＮＡ　３．１一Ｓｍａｄ４构建成功；测序结果确定插入片段无突变，序列完全正确。重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１一Ｓｍａｄ２、ｐｃＤＮＡ３．１一　Ｓｍａｄ３、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓｍａｄ４转入ＥＬ４细胞后上调目的蛋白Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４蛋白的表达。结论成功构建ｐｃＤ—　ＮＡ３．１一Ｓｍａｄ２、ｐｃＤＮＡ３．１一ｓｍａｄ３和ｐｃＤＮＡ３．１一Ｓｍａｄ４真核表达质粒；将Ｓｍａｄ真核表达质粒成功转染入ＥＬ４细胞，　诱导细胞内目的蛋白高表达。　关键词：Ｔ淋巴瘤细胞；Ｓｍａｄ蛋白；真核表达质粒　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１８．２１．００３　中图分类号：Ｒ７３３．４　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—２６６Ｘ（２０１８）２１－０００９－０４　

胰腺十二指肠同源框1基因在大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化过程中的作用

胰腺十二指肠同源框1基因在大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化过程中的作用

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＮＡＴＯＭＹ　Ｖｏ１．３０　Ｎｏ．３　２００７　解剖学杂志２００７年第３Ｏ卷第３期　

胰腺十二指肠同源框１基因在大鼠骨髓间充质干细胞向　胰岛素分泌细胞定向分化过程中的作用　于　丽　孙吉平　△　陈燕春　岳炳德　管英俊　（１潍坊医学院组织学与胚胎学教研室，潍坊２６１０４２；２南京军区南京总医院，南京２１０００２）　摘要　目的：探讨胰腺十二指肠同源框１基因（ＰＤＸ一１）在大鼠骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）向胰岛素分泌细胞定向分化　过程中的作用。方法：新型纳米载体Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ介导含有ＰＤＸ－１基因的真核表达载体转染骨髓ＭＳＣｓ，Ｇ４１８筛选，分　步法进行体外诱导；流式细胞仪检测诱导后胰岛素阳性细胞的比例，ＳＡＢＣ免疫细胞化学染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测　诱导后细胞胰岛素蛋白的表达；ＥＬＩＳＡ法检测诱导后细胞对葡萄糖刺激的反应能力。结果：Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ可高效介导重　组载体在骨髓ＭＳＣｓ表达，随着转染时间延长，表达逐渐增强；ＰＤＸ～１　ＭＳＣｓ分化为胰岛素阳性细胞数较转染空白载　体和ＰＤＸ－１一ＭＳＣｓＳ￣［明显增多；诱导后细胞表达胰岛素，转染ＰＤＸ－１基因后表达明显增加；ＰＤＸ－１　ＭＳＣｓ对不同浓度　的葡萄糖刺激表现出不同的胰岛素分泌反应。结论：骨髓ＭＳＣｓ体外能分化为胰岛素分泌细胞，ＰＤＸ－１能显著提高　其分化效率。　关键词胰腺十二指肠同源框１基因；骨髓间充质干细胞；胰岛素分泌细胞；细胞分化　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｏｄｅｎａｌ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　ｇｅｎｅ－１　ｉｎ　ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　

Ｙｕ　Ｌｉ。。Ｓｕｎ　Ｊｉｐｉｎｇｚ△，Ｃｈｅｎ　Ｙａｎｃｈｕｎ　，Ｙｕｅ　Ｂｉｎｇｄｅ。，Ｇｕａｎ　Ｙｉｎｇｊｕｎ。　（１　Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｗｅｉｆａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｅｉｆａｎｇ　２６　１０４２，Ｃｈｉｎａ；　２　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｃｏｍｍａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐａｍｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｏｄｅｎａｌ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ（ＰＤＸ－１）ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｉｎｔｏ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ。　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＰＤＸ－１　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＭＳＣｓ　ｂｙ　Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ，Ｇ４　１８　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｎ　ＰＤＸ－　１　ＢＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．ａｎｄ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅ—　ｔｒｙ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒ—　ｅｎｔｉａｔｅｄ　ＭＳＣｓ．Ｉｎｓｕｌｉｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ＭＳＣｓ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｔｏ　ｇｌｕｃｏｓｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＰＤＸ一１　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｈｉｇｈ　ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ＭＳＣｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ：ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ＰＤＸ一１　ＭＳＣｓ　ｗａｓ　ｍｕｃｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｆｒｏｍ　ＢＭＳＣｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｖａｃａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ：ｔｈｅ　ｈｕｍ—　ｂｅｒ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ＰＤＸ一１＋ＭＳＣｓ　ｗａｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｆｒｏｍ　ＰＤＸ：Ｉ－ＭＳＣｓ；ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｃｈａｌ—　ｌｅｎｇｅｄ　ｂｙ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｉｎ　ＰＤＸ一１　ＭＳＣｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＢＭＳＣｓ　ｃａｎ　ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ。ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｂｅ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ　ｂｙ　ＰＤＸ－１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｏｄｅｎａｌ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ－１　ｇｅｎｅ；ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ；ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，　ＭＳＣｓ）是一类具有极强自我更新能力及多向分化潜　能的干细胞［１］，体外可横向分化为胰岛素分泌细　胞［２］，表达多种胰岛ｊ３细胞发育和功能相关的基　因Ｌ３ｊ，但胰岛素分泌量低，远不能满足移植治疗糖尿　病的需要Ｌ４］。胰腺十二指肠同源框１基因（ｐａｎｃｒｅａｔ一　

医学论文-大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

医学论文-大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

医学论文-大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

医学论文-大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的

构建

【摘要】 分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株,为

细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。,方法,采用Percoll不连续密

度梯度离心法分离骨骺干细胞,利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗

原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T,PUR转染骨骺干细胞,经嘌呤霉素筛选,

抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色,观

察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线。用免疫细胞化学法和RT-PCR

检测SV40Tag在转染细胞中的表达。,结果,转染后获得一个阳性细胞克隆,

免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性。SV40Tag抗体染色和RT-PCR结

果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞。转染细胞经扩大培养,命名为永生

化骨骺干细胞。,结论,成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的

骨骺干细胞株。

【关键词】 骨骺干细胞 永生化 猿肾病毒40

Abstract:,Objective,To separate rat precartilaginous stem

cells (PCSCs) and establish immortalized precartilaginous stem

cell(IPCSC) strain which provides stable cell resource for cell-transplantation and gene therapies.,Method,PCSCs were isolated by

discontinuous Percoll gradient centrifugation. The specific marker

(anti-FGFR- 3) of PCSCs was used to identify the cultured cells by

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

刘培;曹毅;陈微;刘改荣;杨晓红;陶茂灿;罗宏宾

【摘 要】[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础.[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒.[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1 真核表达载体.[结论]pcDNA3A(+)-NRP1 真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础.%[Objective] To clone full-length cDNA of Neuropilin-1(NRP1) gene

from Human Keratinocytes Cell line (HaCaT) and construct reco-mbinant

cukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-NRP1, and pave the road for

deeply research on functions of NRP1. [Methods] The full-length cDNA of

NRP1 was amplified from HaCaT cells by RT-PCR and then cloned into

pMD18-T vector through TA base pairing. After identification by DNA

sequencing, the plasmid pMD18 -T -NRP1 was digested by restriction