下载文档原格式
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。
方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。
流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。
结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。
8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。
流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。
结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and tocultivate Zou Jin. Hun an Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Provin ce, Changsha 410007, China【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle,after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and cultureof rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation.【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。
大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定作者：李兰兰陈玲肖马炬明来源：《中国现代医生》2014年第01期[摘要] 目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养方法。
方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。
结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。
生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02% P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。
BMSCs 高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。
成脂诱导21 d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。
成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。
结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。
[关键词] 骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0007-04BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点[1-2]，使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。
但是骨髓中的间充质干细胞含量极低[3]，且其含量随年龄增长而逐渐减少[4]，需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。
实验旨在建立一套简便有效的BMSCs原代培养方法，为后续实验做好准备。
1 材料与方法1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100 g，由浙江省实验动物中心提供。
实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 时间及地点于2013年1～6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。
1.3 实验主要试剂低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素（吉诺生物），优质胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen公司）。
全骨髓贴壁法提取并培养大鼠MSCs一、实验准备1、器材准备：①无菌手术器械（3把眼科剪，3把大剪刀，3把镊子，血管钳若干，刀柄1把，针头若干，注射器若干）②离心管2个③酒精灯④吸管若干⑤无菌弯盘两个⑥200目过滤网⑦瓶皿、培养瓶若干。
2、试剂准备：①DMEM培养基②胎牛血清③氯化铵（破除红细胞用）④PBS液二、实验步骤1、颈椎脱臼法处死大鼠，头朝上浸泡于77%酒精中。
2、在超净台上，将大鼠置于无菌弯盘上，用器械逐层解剖，取下双股骨置于瓶皿中。
3、换无菌手套及手术器械，仔细去除股骨上附着的肌肉组织，并用PBS浸泡于瓶皿中。
4、用针头在股骨两头刺几个孔，用针筒抽取PBS冲洗骨髓腔至骨髓发白为止。
5、取新瓶皿及200目过滤器过滤上述冲洗液，用吸管碾磨。
6、将瓶中悬液移入离心管中，1200转，5分钟。
7、去上清加入5ml氯化铵，混匀静置5分钟，再混匀静置5分钟，加PBS5ml吹打混匀，1200转，5分钟离心。
8、去上清在一管离心管中加入20%胎牛血清的DMEM培养基3ml，将所有离心管合为一管，吹打混匀。
9、计数密度：取PBS95ul+细胞悬液5ul（相当于稀释20倍）置于瓶皿盖上，用移液枪混匀，取10ul置于计数板上计数。
离心管中的细胞密度=视野中细胞数×稀释倍数×离心管中液体体积×104 ，以上述为例密度=细胞计数×20倍×3ml×104。
稀释倍数以视野内计数方便为准。
10、按107左右将上述细胞接种于培养瓶中，上述密度计算为13×107，则需接种10余瓶。
每瓶0.3ml细胞液+20%胎牛血清DMENp培养基5.7ml(相当于稀释20倍)。
11、将培养瓶置于37。
C，5%CO2的孵育箱中。
2小时后换液。
◇技术方法◇大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察康新勤1,臧伟进1,宋土生2,于晓江1,曾菊绒1(西安交通大学医学院:1.心血管生理药理研究室;2.生物学教研室,陕西西安 710061)摘要:目的 分离和培养大鼠骨髓组织中的间充质干细胞,并观察其生长形态。
方法 利用造血干细胞和骨髓间充质干细胞不同生长特性,采用贴壁法分离并用含15%(体积分数)FBS的低糖型DMEM培养基培养。
结果 分离培养得到的细胞中随着换液次数的增加红细胞和造血细胞逐渐减少;骨髓组织中贴壁得到间充质干细胞呈梭形、纺锤形和多角形。
结论 贴壁法可以分离培养骨髓中的间充质干细胞。
关键词:骨髓间充质干细胞;分离;培养中图分类号:R329.2 文献标识码:B 文章编号:167128259(2003)0520518202 1999年《Science》杂志将干细胞研究列为当年十大科学研究之首。
干细胞研究已成为生命科学的一个主攻热点。
骨髓中至少包含两种干细胞成分———骨髓间充质干细胞和骨髓造血干细胞。
现在的研究揭示骨髓间充质干细胞有分化成多种细胞的潜能1,包括心肌细胞2、肝细胞3、脑中的神经细胞和非神经细胞4、内皮细胞、成骨细胞和肺泡上皮细胞5等。
研究骨髓细胞的分化潜能,首先要分离骨髓中的间充质干细胞。
本文根据骨髓中造血细胞和间充质干细胞的不同生长方式,采用一种较简单的分离方法,并观察了大鼠骨髓间充质干细胞的生长形态。
1 材料和方法1.1 实验材料 Sprague2Dawley(SD)大鼠由本校实验动物中心提供;低糖型DMEM培养基购自GIBCO公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青犊牛研究所;青霉素和链霉素购自市售的华北制药有限责任公司。
15%(体积分数)FBS的DMEM细胞培养基由15%(体积分数)FBS、DMEM培养基、100IU・mL-1青霉素及100IU・mL-1链霉素组成。
1.2 方法 取1月龄SD大鼠1只,雌性,体重88g。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离冻存及向成骨细胞和软骨细胞诱导分化张文元;杨亚冬;房国坚;陈勇【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2006(16)9【摘要】目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离、纯化、增殖、冻存的方法,并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性.方法取SD大鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法以及单独用贴壁培养法分离纯化MSC,增殖,并测定其生长曲线.MSC在12.5%DMSO条件下经液氮冻存半年复苏,测其存活率.对第3代大鼠MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况.对第3代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化,测定诱导后的细胞表型情况.结果大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,生长曲线呈S型.MSC于液氮冻存半年后复苏,其存活率为80%.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性显著提高,并出现矿化结节沉积.在成软骨诱导剂作用下,可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形,并分泌异染基质,甲苯胺蓝染色呈阳性,表现为软骨细胞分化特点.结论获得的SD大鼠MSC生长旺盛,增殖能力强.在特定诱导条件下,大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞,具有成骨及成软骨分化潜能.【总页数】4页(P1306-1309)【作者】张文元;杨亚冬;房国坚;陈勇【作者单位】浙江省医学科学院生物工程研究所,浙江,杭州,310013;浙江省医学科学院生物工程研究所,浙江,杭州,310013;浙江省医学科学院生物工程研究所,浙江,杭州,310013;浙江省医学科学院生物工程研究所,浙江,杭州,310013【正文语种】中文【中图分类】R-332【相关文献】1.人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化成骨细胞的实验研究 [J], 饶国洲;李晓红;李昂;牛洁;周玉宝2.生物复合材料体外诱导分化 SD 大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞分析 [J], 卞铁荣;王莉丽;邢宏运;唐利;姜海宇;刘露阳;吴长君;汪勇3.山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化 [J], 张晓强;李旭;吴涛;黎健伟;杜浩;裴国献4.大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立 [J], 李伟;王翠喆;许彭;哈小丹;刘宗智;王婷婷;谢建新;张君5.兔骨髓间充质干细胞分离培养及向成骨细胞表型的诱导分化 [J], 张文元;杨亚冬;贺晨;房国坚;陈勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。
方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。
结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。
经传代扩增,细胞进一步纯化。
细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。
论文百事通FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。
结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。
【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biologicalcharacteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。
MSC、ATDC5培养（Su, et al,2010, HMG）(1) MSC培养及诱导向软骨细胞分化：1) 6～8 周龄小鼠(每组2～3 只)脱臼处死后置于75%酒精浸泡10min，无菌条件下分离出胫骨、股骨；2) 将股骨、胫骨放入4℃PBS 液的培养皿中，吹洗附着的血迹。
用剪刀剪去股骨两端，用一次性注射器吸取含有10% FBS 的DMEM(低糖)培养液反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲入无菌培养皿中(或PBS 液反复冲洗骨髓腔)；3) 将细胞置于37℃、5%CO2 培养箱中培养。
24h 后细胞首次换液，并以PBS 轻柔洗涤以去除非贴壁细胞，以后每3d换一次液；4) 细胞纯化：以体外贴壁法去除悬浮生长的细胞。
所贴壁的细胞除骨髓基质细胞外，还有巨噬细胞、单核细胞。
利用胰酶消化后，MSC 较易脱落的特点将其纯化。
细胞80～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化3min 后吹打，脱落细胞1000rpm 离心10min，按1:2比例传代培养。
选取生长良好的第2代细胞进行实验。
5) 取生长状态良好的第二代BMSC，以5×105/孔接种于6 孔板中，用含10% FBS 的DMEM 低糖培养基培养细胞。
待细胞生长达到80%融合时，换用软骨诱导培养液，即用含有10% 胎牛血清，10ng/ml TGF-β1，50µg/ml 抗坏血酸，10-7 mol/L 地塞米松和1×ITS-plus(胰岛素转铁蛋白硒)的DMEM高糖培养基进行软骨诱导，每三天换液一次。
(2) A TDC5培养：用含5%FBS和1×ITS-plus的DMEM/F12培养基进行培养，按本实验室常规方法进行成软骨诱导（同上）。
中国组织工程研究与临床康复 第13卷 第36期 2009–09–03出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2009 Vol.13, No.36ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH7073Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, ChinaCai Peng ★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, Chinawarriormd@Correspondence to: Zhu Shao-xing, Doctor, Chiefphysician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China zsxing2005@126. comSupported by: the Natural ScienceFoundation of Fujian Province, No. C0710018*Received: 2009-06-12 Accepted: 2009-07-25全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化*★蔡 鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence methodCai Peng, Zhu Shao-xing, Su Yi-ming, Huang Shi-yong AbstractCai P, Zhu SX, Su YM, Huang SY.Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7073-7077. [ ]摘要蔡鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(36):7073-7077. [ ]基础医学蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7074www.CRTER.org福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001蔡 鹏★，男，1982年生，福建省漳州市人，汉族，福建医科大学在读硕士，医师，主要从事干细胞在泌尿外科疾病治疗方面的研究。
warriormd@qq. com通讯作者：朱绍兴，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001zsxing2005@ 福建省自然科学基金资助项目(C0710018)*中图分类号:R394.2 文献标识码:B文章编号:1673-8225 (2009)36-07073-05收稿日期：2009-06-12修回日期：2009-07-25 (20090522021/ ZS ·Q)0 引言由于骨髓间充质干细胞具有诸多优势，其作为种子细胞在组织工程、细胞替代治疗、基因治疗等领域得到了日益广泛的应用[1-6]。
但骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞[7]，需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。
实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养方法，观测骨髓间充质干细胞生物学特性，及其成骨、成脂分化潜能，为后续进行基因修饰骨髓间充质干细胞及体内移植实验做好准备。
1 材料和方法设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。
材料：清洁级雄性近交系SD 大鼠30只，四五周龄，体质量80~100 g ，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK 沪2007-0005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
实验用主要试剂：实验方法：大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养：用1 mL注射器抽取体积分数为10%水合氯醛0.3 mL 腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min 。
铺无菌单盖住大鼠上身，无菌条件下分离出双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM 浸泡清洗。
眼科剪切除两端骨骺，显露骨髓腔，用10 mL 注射器吸取L-DMEM 培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓，反复冲洗待骨髓腔变白后停止。
收集骨髓悬液于15 mL 离心管中，1 000 r/min 室温离心3~5 min ；离心后去上清，用5 mL 新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至25 cm 2培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO 2饱和湿度培养箱中培养。
约48 h 后首次换液，以后每两三天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。
大鼠骨髓间充质干细胞的纯化扩增：待细胞融合至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS 轻轻冲洗后，吸去PBS 。
加入2.5 g/L 胰蛋白酶1.0~2.0 mL ，于培养箱中温育1.0~2.0 min ，置于显微镜下观察细胞形态变化，待镜下细胞之间突起消失、变圆后，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化，用吸管轻轻吹打数次，转移至15 mL 离心管，1 000 r/min 室温离心5 min ，弃上清，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬，用吸管轻柔吹打成细胞悬液。
计数板计数后，调整细胞密度，以5 000个/cm 2接种于新的25 cm 2培养瓶，置于37 ℃、含体积分数为5%的CO 2饱和湿度培养箱中继续培养。
以后每两三天换液1次，此时细胞记为P1(第1代)，以后待细胞80%~90%融合后重复上述步骤进行传代。
流式细胞仪检测细胞表面标记：待P3细胞融合至90%左右，吸去培养基，用PBS 充分洗涤细胞2次，加入2.5 g/L 胰蛋白酶室温消化1 min ，加入新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM 培养基终止消化，吸管仔细吹打，1 000 r/min 室温离心7 min ，弃上清，加PBS 并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1×106，分装至EP 管中，1 000 r/min 室温离心7 min ，弃上清，于待检测的样本中各加入90 µL PBS ，轻轻吹打成细胞悬液，分别加入CD34，CD90，CD11b ，CD106，CD44，CD45一抗及其同型对照各10 µL ，充分吹打混匀，37 ℃避光孵育30 min 后，测试前再加400 µL PBS 至总体积500 µL ，充分混匀，上机检测。
向成骨细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充质干细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105/孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d 后，诱导组加入2 mL 成骨诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d 换液1次。
成骨诱导14~21 d 后进行茜素红染色。
试剂来源低糖DMEM 细胞培养基、优质胎牛血清 EDTA-胰酶 FITC 标记小鼠抗大鼠CD34、 CD90单克隆抗体 FITC 标记小鼠抗大鼠CD44、CD45、CD106、CD11b 单克隆抗体 茜素红、油红O成骨诱导分化培养液、成脂诱导分化培养液Hyclone 公司Gibco 公司ABD Serotec 公司Biolegend 公司Sigma 公司 广州赛业公司蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH7075www.CRTER.org向成脂肪细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充质干细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105/孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d 后，诱导组加入2 mL 成脂肪诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d 换液1次。
成脂肪诱导14 d 后进行油红O 染色，检测脂肪沉积情况。
设计、实施、评估者：设计为第一~三作者，实施为第一、三、四作者，由第二作者进行评估。
均经过系统培训，未使用盲法评估。
2 结果2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察2.2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代骨髓间充质干细胞均一表达CD90，CD44，CD106，阳性率分别为91.50%，99.87%，78.02%；而CD34，CD45，CD11b 呈阴性，阳性率分别为0.07%，0.15%，0.21%，见图2。
2.3 成骨诱导分化鉴定 成骨诱导21 d 后茜素红染色，诱导组显示大量橘红色矿化结节形成，对照组呈阴性，见图3。
a: 5 days of primary cultureb: 9 days of primary culturec: 4 days of P2 BMSCsd: 4 days of P5 BMSCsFigure 1 Morphological observation of rat bone marrowmesenchymal stem cells (BMSCs) of primary and successively passaged culture(×100)图1 原代及连续传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞形态观察(×100)a bFigure 2 Surface marker expression of P3 rat bone marrow mesenchymal stem cells图2 第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达c d e f g h iFITC-isotypism control was shown in Figure 2a and PE-isotypism control in Figure 2d, Figure 2h. The quantitative data of CD34 was shown in Figure 2b,CD90 in Figure 2c,CD44 in Figure 2e,CD45 in Figure 2f,CD106 in Figure 2g,CD11b in Figure 2i, respectively蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7076www.CRTER.org2.4 成脂诱导分化鉴定成脂诱导2周后油红O 染色，诱导组可见细胞以长梭形为主，胞浆内出现大量红染的脂滴，折光性较强，形态大小不一，成串排列或围绕细胞核分布，部分脂滴融合为较大团块，将细胞核挤向一边；对照组染色后细胞内未见红染脂滴，见图4。
