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一44一重庆医科大学学报2∞8年第33卷增刊l(J oum aI of C h ong qi ng M ed i caI U n．vers i ty2∞8．V o|．33No．s1)基础研究文章编号：0253—3626(2008)sl—0044—04大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究何梅-，王学峰，马珊珊：，席志芹(1．重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016；2．山西医科大学第一附属医院神经内科，太原030001)【摘要】目的：探索体外培养大鼠神经干细胞(N eur al st e m ceus，N s cs)的方法和实验条件，建立一种较为可靠的神经干细胞培养方法。
方法：分别选取孕14～16ds D胎鼠和新生1d的sD大鼠进行神经干细胞培养，采用单纯机械吹打和机械吹打加酶消化丽种方法进行消化，对培养出的细胞进行神经干细胞、神经元、神经胶质细胞的免疫细胞化学和免疫荧光鉴定。
结果：用2种来源的大鼠培养出的原代细胞，均表达N es t i n，诱导分化后的细胞表达G FA P和M A P-2。
结论：大鼠神经十细胞的原代分离与培养的关键是单细胞悬液的获得，消化液浓度太高或消化时间太长，容易因消化过度致细胞损伤甚至死亡。
胎鼠来源者神经球形成早，数量多。
增殖活力更强，但原代取材过程易被污染。
新生鼠来源者鼠源易获得，组织取材过程操作简单，但神经干细胞成球率低。
【关键词】神经干细胞；细胞培养；免疫荧光；免疫生化【中国图书分类法分类号】R74l【文献标识码】A【收稿日期】2007一08—29St udV on i soI at j on and cul t ur e O f neur aI s t em C e¨s f r O m r at br ai nH E M ei．e￡击0D epdr t m em《N e酣ol ogy，t k F订st A航l谴ed H ospi斌，C hongqi唱M ed记击U n洳er s畸)【A bst ract】O巧ec渤e：To es讪l i s h岫m em od of cul t ur i ng neur al哟m ceus(N s cs)妇n ra t brai n．胁跏ds：E14～16sD吣一br yoni cm￡brai n粕d pos t nat aJ one—da y(P1)r a t br aj n w e r e r es pecti vel y ch ose t o cul t l l r e ne u m l st e m ceU s，an d t’帕diges t ive m et h—ods t}l at s i m pk m e ch肌i ca l di ges t i on a nd m e chan i ca l com bi ned诵t}l che m i c al diges t主on w e r e u8ed t o det e兀ni ne t l l e bes t condi—t ions i n pr i m ar y cuhur e．I m m un∞yt oc hem i st I y and i m m u noⅡu or e sce nc e w er e us ed t0i dent i母N SC s，ne urons a nd neum di al cel l s．R8s饿捃：B o t h t l l e pri m a巧ceu s f r o m t w o dⅢbr ent ki nds0f ra t bm i ns ex pr es sed nes ti n aJ l t i g en粕d t}l e di任br en t i ated cel l s ex—pr e ssedG F A P锄d M AP一2明t i gen．∞似砌6s暮D竹：ne key poi nt of pr i m ar y N SC s cul t ur e w鹊obt ai ni ng t he m on叩l鹊t s u叩ens i on．0ver di gest i on l ed t o c eu i nj u r y ev en de am．N SC s舶m em br yoni c ra t br ai n had bet t er pm l i f er at i on abi l i t y粕d co ul d f0肌ceⅡcl ones ea r l i er粕d m or e t}I an N SC s f南m new b om E a t br ai n，but t11e y w e r e e鹊i er t o be contam i nat ed．0h t ai n i ng new b om m t bm i n锄d i sol ati on N SC s舶m new bom ra t br ai n w er e e鹊i er，b ut N SC s舶m new bom ra t br ai n had w o璐e pm l如m t i on abi l吼【K ey w or ds】N eur al st e m ce ns；ceu cu l t u r e；I m m un onu or esc enc e；I m m uno cyt o che m i st r yN S cs是一种原始的未分化细胞，它有和成熟神经细胞相同的基因，且具有自我增殖和多向分化的潜能，神经干细胞研究是21世纪生命科学研究的重要领域。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。
方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。
流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。
结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。
8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。
流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。
结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and tocultivate Zou Jin. Hun an Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Provin ce, Changsha 410007, China【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle,after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and cultureof rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation.【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。
大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定韩玮;苏力担卡扎·仇曼;何铁英;程坤;郝晓文;王松;陈启龙【摘要】目的：探索大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的分离、培养及鉴定方法。
方法采用贴壁分离方法，分离纯化3～4周龄 SD 大鼠的骨髓间充质干细胞，观察细胞生长状况，分别用免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核的方法鉴定 BMSCs 纯度及活性。
结果原代 BMSCs 呈圆形、大小均一，透光性可，24 h 后开始贴壁，2 d 后开始长出伪足，7～8 d 细胞融合达90％，纯化后 BMSCs 呈梭形，24 h 细胞贴壁率可达99％，前4代细胞传代周期为7 d，之后传代周期逐渐缩短。
第3代BMSCs 的表面标志物 CD29阳性表达率为98．9％，CD44阳性表达率为73．3％。
DAPI 标记的 BMSCs 胞核可见明亮蓝色荧光，标记率达100％。
结论贴壁分离法分离大鼠 BMSCs，可得到纯度较高、活力强的 BMSCs，第3代BMSCs 生物学性状稳定。
%Objective To explore the methods of separate,culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Methods By adherent separation method,bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified from 3-4 weeks old SD rat,then cell growth was observed,respectively by im-munofluorescence staining,flow cytometry and DAPI nuclear staining method for identification of BMSCs purity and activity.Results Primary BMSCs was round,uniform in size and light in transmission.After 24h begin to adherent,2 d began to grow following pseudopodia,90% of the cells were fused on 7-8 d, and purified BMSCs werefusiform.24 h cell adherent rate was 99% and before the 4th generation cell cycle was 7 days.After subculture,cycle graduallyshortened.The results of surface markers of the third gener-ation MSCs showed thatthe positive rate of CD29 was 98.9%,and the positive rate of CD44 was 73.3%. DAPI labeled BMSCs,the nucleus can see bright blue fluorescence,labeling rate of 100%.Conclusion Adherent separation of rat BMSCs have high purity and strong vitality of BMSCs,and the third generation of BMSCs shows stable biological character.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2016(039)009【总页数】4页(P1155-1158)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;大鼠【作者】韩玮;苏力担卡扎·仇曼;何铁英;程坤;郝晓文;王松;陈启龙【作者单位】新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054【正文语种】中文【中图分类】R33骨髓间充质干细胞(BMSCs)为非造血干细胞，存在于骨髓中，易于获得及分离培养，可诱导为多重细胞，分泌多重生长因子、酶及趋化因子，在组织器官的修复及促进组织器官生长过程中起到关键作用[1]。
大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定
王小飞;富赛里;王惠民;陈建;陆佩华
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2006(046)001
【摘要】探讨胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)的分离培养和鉴定方法.采用无血清培养液,从胚胎大鼠脊髓分离和培养NSCs,应用3H-TdR掺入技术和免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定.结果表明,从E16胚胎大鼠脊髓分离培养的细胞具有NSCs特征,可在体外增殖存活,经1%胎牛血清诱导可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.认为从胚胎大鼠脊髓成功分离培养的NSCs可在体外稳定地培养和传代,是研究细胞移植和基因治疗的理想细胞来源.【总页数】3页(P23-25)
【作者】王小飞;富赛里;王惠民;陈建;陆佩华
【作者单位】南通大学附属医院,江苏,南通,226001;上海第二医科大学;上海第二医科大学;南通大学附属医院,江苏,南通,226001;南通大学附属医院,江苏,南通,226001;上海第二医科大学
【正文语种】中文
【中图分类】R331
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5.新生大鼠脊髓神经干细胞的分离培养及鉴定 [J], 胡建石;郑志竑;林玲;林建银因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定燕学波;杜运华;吕安林;邢玉洁;胡朝晖;胡新君;岳峰【摘要】目的研究大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法.方法采用颈椎脱臼法处死大鼠,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出骨髓间充质干细胞.然后通过换液培养去除悬浮不贴壁的细胞.待原代细胞长满培养瓶底85%左右时传代.倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原 CD44、CD45表达情况.结果在倒置显微镜下,刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形或球形,体积小,折光性强.3 d 后大部分细胞贴壁,体积较小,形态多样,为椭圆形、短梭形.2周形成集落,细胞数量明显增多,体积增大,以长梭形为主,呈放射状向四周扩展.传代后细胞生长旺盛,呈长梭形、旋涡状生长,且细胞形态均一,趋向一致.流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞表面抗原 CD44阳性表达率为(89.98±1.29)%,CD45阳性表达率为(2.14±0.22)%.结论联合细胞形态学变化及细胞表面标记抗原 CD44和 CD45的鉴定,采用密度梯度离心法联合差速贴壁法能够获得纯化的大鼠骨髓间充质干细胞.% Objective To investigate isolation, culture and identification of rat BMMSCs. Methods Rats were killed by cervical dislocation, BMMSCs were isolated from bone marrow of SD rats by density gradient centrifugation. Other cells mixed in BMMSCs were removed by differential adhesion method, then the purified BMMSCs were obtained. The cells grown to 85 % confluence were digested and passaged at the ratio of 1:2 till fourth passage in vitro. The morphological changes were observed under phase contrast microscope during the culture and passage of BMMSCs.The positive surface marker CD44 and negative marker CD45 of cells were detected for the identification of BMMSCs withflow cytometry. Results Primary BMMSCs were smaller and had varied shapes, most of cells were of oval or short spindle and had strong refraction. The majority adhered after 3 d, and the cells showed morphological diversity ranging from oval, short spindle, to triangular or star-shaped. After 2 w, the adherent cells rapidly proliferated and formed large or small colonies. After passage, the cells were larger than the original cells and showed elongated spindle, arranged the same trend. The results of flow cytometry showed that CD44 expression of BMMSCs was (89.98±1.29)%, CD45 positive expression rate was (2.14±0.22)%. Conclusion The purified BMMSCs were obtained by density gradient centrifugation combined differential adhesion method. The purified BMMSCs could be identified by detecting positive surface antigen CD44 and negative surface antigen CD45.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2012(000)010【总页数】3页(P931-933)【关键词】骨髓间充质干细胞;CD44;CD45;分离;鉴定【作者】燕学波;杜运华;吕安林;邢玉洁;胡朝晖;胡新君;岳峰【作者单位】河南信阳，154 医院心肾内科;河南信阳，154 医院心肾内科;陕西西安，解放军第四军医大学西京医院心内科;陕西西安，解放军第四军医大学西京医院心内科;河南信阳，154 医院心肾内科;河南信阳，154 医院心肾内科;河南信阳，154 医院心肾内科【正文语种】中文【中图分类】Q2-33近几年自体骨髓间充质干细胞（BMMSCs）移植技术发展迅速，逐渐成为治疗心肌梗死后心衰的有效办法之一。
大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞.方法无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨,用冲洗法冲出骨髓,用直接贴壁法分离纯化MSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定,并检测第3代MSCs的细胞周期.结果体外培养的原代MSCs 72 h内可见有少量贴壁细胞,7 d左右达到汇合.免疫细胞化学示,MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性,而CD14、CD34、CD45表达阴性.流式细胞仪示,CD14阳性率为0.19%、CD29为64.36%、CD34为0.17%、CD44为86.73%、CD45为0.18%、CD73为90.21%、CD105为74.25%、CD166为54.60%.细胞周期显示,第3代MSCs约有90%的细胞处于G0/G1期.结论MSCs在体外很容易分离培养和扩增,DAPI标记MSCs敏感性好,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径.作者：何忠杰马俊勋方驰华杨丽萍作者单位：何忠杰,马俊勋(南方医科大学附属珠江医院普通外科,广东,广州,510280)方驰华(中国人民解放军总医院304急救部,北京,100037)杨丽萍(中国人民解放军总医院304烧伤研究所,北京,100037)刊名：中国急救医学 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CRITICAL CARE MEDICINE 年，卷(期)：2005 25(12) 分类号：Q503 Q813.1+1 关键词：骨髓间充质干细胞分离培养表型细胞周期大鼠流式细胞仪。
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定目的：对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定，观察其生长方式和分化特征。
方法：运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养，对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin 表达情况。
用血清诱导其分化，分化7 d后，采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulin Ⅲ、Galc的表达情况。
结果：大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中，呈悬浮状态生长，形成细胞球，经免疫荧光检测，细胞球呈CD133和Nestin阳性。
将细胞球转入含血清培养基后，转为贴壁生长，经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性，少部分细胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc阳性。
结论：采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。
脑血管病是威胁全世界人类生命健康的一类疾病，其中缺血性脑梗死作为神经系统的常见病、多发病，其发病率、病死率和致残率均很高。
且随着人口结构的老龄化和吸烟人口的增加，脑血管病的发病率有进一步上升的趋势。
传统的治疗方法包括药物、康复理疗和功能锻炼等，但效果均不理想。
近年来，随着干细胞（Stem cells，SCs）理论的提出，不少研究者相继报道从神经组织、脂肪组织、骨髓等组织中分离并培养出了各自的干细胞，其中神经系统来源的干细胞被称之为神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）[1]。
近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，部分研究者将骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成功诱导为骨髓源神经干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs）[2]。
BMSCs-NSCs的开发和应用，克服了从成体脑组织中获取神经干细胞和危险性和局限性，也避免了胚胎来源干细胞移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。
骨髓基质细胞源性神经干细胞的移植治疗修复中枢神经系统损害成为了研究重点，这给脑梗死的细胞移植治疗带来了新思路[1-3]。
因此，本研究选用Wistar大鼠骨髓基质细胞，运用含bFGF和EGF的无血清DMEM/F12培养基对其进行诱导培养，拟培养Wistar大鼠骨髓源神经干细胞，为骨髓源神经干细胞的进一步研究打下基础，现具体报道如下。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物成年Wistar大鼠，雄性，体重（200±50）g，购于兰州大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002。
1.1.2 主要试剂DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶（购自Gibco公司）。
胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。
B27添加剂购自Invitrogen 公司。
表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自Peprotech 公司，小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon 公司，小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulin Ⅲ抗体购自Abcam公司，兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。
Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG购自Molecular Probes公司。
DAPI封片剂购自Vector Laboratories公司。
1.2 方法1.2.1 Wistar大鼠骨髓基质细胞的分离、培养和鉴定将所选大鼠无菌条件下取双侧股骨和肱骨，取5 mL无菌注射器，用10 mL DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，用吸管将骨髓组织悬液反复吹打均匀，1000 r/min，离心5 min后，以含10% FBS的DMEM/F12含血清培养基重悬，接种于25 cm2培养瓶，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
骨髓细胞通过直接贴壁法培养，根据大鼠骨髓基质细胞贴壁生长的特征，采用差异贴壁法，定期更换掉不贴壁的细胞，得到贴壁生长的骨髓基质干细胞，48 h后更换培养基，培养条件同前，去除未贴壁细胞，并以PBS 缓冲液轻轻冲洗2遍。
以后每隔72小时换液1次，待原代细胞达到90%融合后，用0.25%胰酶消化进行传代，通过传代培养进行纯化及扩增。
1.2.2 Wistar大鼠骨髓源性神经球的诱导培养及鉴定大鼠骨髓源性神经干细胞的培养方法采用无血清悬浮培养法，选择第四代在含血清培养基中培养呈对数生长期的贴壁骨髓基质细胞，用0.25%胰酶消化，吸管反复吹打制成单细胞悬液，以含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF及使用浓度为1∶50的B27添加剂的DMEM/F12培养基重悬，调整活细胞密度为2×105/mL，接种于25 cm2培养瓶中，置37 ℃，5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，约2～3 d换半液1次，并添加半量bFGF、EGF、B27等生长因子。
1.2.3 Wistar大鼠骨髓源性神经球的CD133和Nestin检测（1）选取在无血清培养基中呈悬浮生长的状态良好的大鼠骨髓源神经球，去除培养基，0.01 mol/L PBS冲洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min；0.01 mol/L PBS冲洗3次；（2）0.3% Triton X-100破膜，室温10 min；0.01 mol/L PBS冲洗3次；（3）10%正常山羊血清封闭60 min；（4）滴加一抗：兔抗CD133（1∶200）和小鼠抗Nestin（1∶100）置湿盒中4 ℃孵育过夜，去除一抗，0.01 mol/L PBS冲洗3次；（5）滴加二抗：Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG（1∶200）和Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠IgG （1∶200），37 ℃孵育1 h，去除二抗后，0.01 mol/L PBS冲洗3次；（6）用含DAPI的封片剂（H-1200，Vector Laboratories）对细胞核进行复染，并封片，荧光显微镜下观察。
（7）同时设阴性对照实验，以抗体稀释液代替一抗，结果镜下不显色，为阴性结果。
1.2.4 Wistar大鼠骨髓源性神经球的分化Wistar大鼠骨髓基质细胞在无血清培养条件下，呈球状聚集生长，选择生长状态良好的大鼠骨髓源神经球，经0.01%胰酶消化制成单细胞悬液或直接将神经球用PBS液清洗，按2×105个活细胞/mL 的密度，接种于含血清培养基（DMEM/F12+10%FBS），置37 ℃，5% CO2、饱和湿度恒温培养箱培养。
分化7 d后，行免疫细胞荧光检测，具体操作步骤如下：（1）去除培养基，0.01 mol/L PBS冲洗2次，用4%多聚甲醛固定30 min；0.01 mol/L PBS冲洗3次，5 min/次；（2）10%正常山羊血清封闭60 min；（3）滴加一抗：小鼠抗GFAP（1∶500），小鼠抗MAP-2（1∶100），小鼠抗β-tubulin Ⅲ（1∶100），小鼠抗Galc（1∶100）置湿盒中4 ℃孵育过夜，去除一抗，0.01 mol/L PBS冲洗3次；（4）滴加二抗：Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠IgG（1∶200）、Alexa Fluor488山羊抗兔IgG（1∶200），37 ℃孵育1 h，去除二抗后，0.01 mol/L PBS冲洗3次；（5）用含DAPI的封片剂（H-1200，Vector Laboratories）对细胞核进行复染，并封片，荧光显微镜下观察。
（6）同时设阴性对照实验，以抗体稀释液代替一抗，结果镜下不显色，为阴性结果。
2 结果2.1 Wistar大鼠骨髓基质细胞的形态学观察通过倒置相差光学显微镜观察发现，至第三代时骨髓基质细胞形态较为均一，已经得到纯化，细胞形态以长梭形为主，体积较小、大小基本一致，增殖速度较快，经多次传代其细胞形态、大小及增殖方式不会发生改变（图1）。
2.2 大鼠骨髓源性神经球的诱导培养、鉴定及CD133和Nestin检测结果DMEM/F12培养基中，大部分细胞呈悬浮生长，形成细胞球，细胞球由几个到几十个细胞组成，大部分细胞球呈圆形，随着培养时间的延长，球体内细胞数量增多，球体增大，但球体内细胞增殖速度较慢，约7～9 d传代1次。
经免疫组织化学检测，所形成的细胞球呈CD133和Nesitn阳性（图2）。
2.3 大鼠骨髓源神经干细胞的分化将大鼠骨髓源神经干细胞去除生长因子，并转入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养后，其生长方式再次发生改变，不再呈悬浮生长，而是再次转为贴壁生长，单细胞及神经球很快发生贴壁，贴壁后细胞不再呈圆形，而是伸出突起，呈梭形、多角形及不规则形等，且其增殖速度较在无血清培养基中为快。
分化7 d后，行免疫荧光细胞化学检测，可表达星形胶质细胞表面标志物GFAP、神经元标志物MAP-2和β-tubulin Ⅲ，少突胶质细胞表面标志物Galc。
其中大部分细胞均呈GFAP阳性，少部分细胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc阳性（图3）。
3 讨论神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是指分布于神经系统的，具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能的细胞[1]，最早由Reynolds等[4]分离得到并提出这一概念，以后的研究发现在中枢神经系统的多个部位存在神经干细胞，如脑室、脑室下区、中脑导水管周围等[1，5]，它具备无限增殖、自我更新及多向分化潜能，其增殖方式包括对称分裂和不对称分裂两种分裂方式，通过对称分裂进行自我更新与增殖，产生两个子代神经干细胞；而通过不对称分裂产生一个神经干细胞，另一个为相对成熟的已分化细胞，通过不对称的分裂方式产生神经组织的各类细胞，如神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。
神经干细胞不仅存在于动物胚胎时期发育的脑组织中，在成年动物脑中也存在。
神经干细胞的主要功能是作为一种后备储备，它在一定条件下可以进行增殖、迁移和分化并参与神经系统损伤修复或细胞正常死亡的更新[6-7]。
但是成体中枢神经损伤后其自我再生能力有限，远远不能完成神经功能的再生修复的功能，特别是大面积受损的中枢神经组织，仅靠自身的神经干细胞修复是无法实现的。
因此，采用外源性干细胞移植治疗中枢神经系统损伤成为目前治疗的主要策略之一[8-11]。
目前干细胞移植修复中枢神经系统损伤的细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质细胞、脂肪源神经干细胞、骨髓源神经干细胞等[12-13]。
