全骨髓法分离培养大鼠MSCs实验指导

大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。

方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。

流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。

结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。

8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。

流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。

结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and tocultivate Zou Jin. Hun an Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Provin ce, Changsha 410007, China【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle,after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and cultureof rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation.【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。

方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。

结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。

经传代扩增,细胞进一步纯化。

细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。

论文百事通FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。

结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。

【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biologicalcharacteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养表型鉴定与标记目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗心、肝、脑等器官急性衰竭提供种子细胞.方法无菌条件下取大鼠股骨、胫骨和腓骨,用冲洗法冲出骨髓,用直接贴壁法分离纯化MSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的MSCs进行鉴定,并检测第3代MSCs的细胞周期.结果体外培养的原代MSCs 72 h内可见有少量贴壁细胞,7 d左右达到汇合.免疫细胞化学示,MSCs CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性,而CD14、CD34、CD45表达阴性.流式细胞仪示,CD14阳性率为0.19%、CD29为64.36%、CD34为0.17%、CD44为86.73%、CD45为0.18%、CD73为90.21%、CD105为74.25%、CD166为54.60%.细胞周期显示,第3代MSCs约有90%的细胞处于G0/G1期.结论MSCs在体外很容易分离培养和扩增,DAPI标记MSCs敏感性好,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,MSCs体外培养成功为细胞移植治疗急危重症器官衰竭提供新的治疗途径.作者：何忠杰马俊勋方驰华杨丽萍作者单位：何忠杰,马俊勋(南方医科大学附属珠江医院普通外科,广东,广州,510280)方驰华(中国人民解放军总医院304急救部,北京,100037)杨丽萍(中国人民解放军总医院304烧伤研究所,北京,100037)刊名：中国急救医学 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CRITICAL CARE MEDICINE 年，卷(期)：2005 25(12) 分类号：Q503 Q813.1+1 关键词：骨髓间充质干细胞分离培养表型细胞周期大鼠流式细胞仪。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。

2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清：用于细胞培养。

4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。

5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。

离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。

2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。

4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

中国组织工程研究与临床康复 第13卷 第36期 2009–09–03出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2009 Vol.13, No.36ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH7073Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, ChinaCai Peng ★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, Chinawarriormd@Correspondence to: Zhu Shao-xing, Doctor, Chiefphysician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China zsxing2005@126. comSupported by: the Natural ScienceFoundation of Fujian Province, No. C0710018*Received: 2009-06-12 Accepted: 2009-07-25全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化*★蔡 鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence methodCai Peng, Zhu Shao-xing, Su Yi-ming, Huang Shi-yong AbstractCai P, Zhu SX, Su YM, Huang SY.Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7073-7077. [ ]摘要蔡鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(36):7073-7077. [ ]基础医学蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7074www.CRTER.org福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001蔡 鹏★，男，1982年生，福建省漳州市人，汉族，福建医科大学在读硕士，医师，主要从事干细胞在泌尿外科疾病治疗方面的研究。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定作者：李显澎樊粤光刘建仁范海蛟江晓兵孙志刚曾建春阳建权【摘要】【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。

【方法】取SPF级SD大鼠6只，采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞，取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定；应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶（ALP）的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。

【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含体积分数为10% 胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液中生长性状相对稳定，增殖速度快；诱导条件下，细胞ALP活性明显增高，并出现了矿化结节。

【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，为中药蛋白质组学研究提供材料基础。

【关键词】骨髓间充质干细胞/病理学；细胞培养，体外的；组织工程骨髓间充质干细胞（MSCs）在体内外诱导因子的作用下，可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化，具有很大的可塑性［1］，这使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点［2］。

为更好地将MSCs应用于骨质疏松症、骨坏死、骨缺损，本实验通过体外细胞培养的方法将MSCs从骨髓中分离纯化，观察MSCs在体外的扩增、鉴定，并诱导其定向成骨分化。

现报道如下。

1 材料与方法1.1 动物 SD大鼠6只，SPF级，体质量140~160 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为：0025033。

1.2 主要试剂与仪器低糖DMEM （L-DMEM，美国Gibco 公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武汉博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；β-甘油磷酸钠（美国Simga公司）；地塞米松（美国Sigma公司）；D-hanks （美国Simga公司）；维生素C（美国Sigma公司）；生物素化抗生蛋白链菌素复合物（streptavidin biotin complex，SABC）（SA1022）试剂盒（武汉博士德公司）；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武汉博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯。

一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。

贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。

贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。

此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。

密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。

梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。

Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。

常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。

Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。

因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。

分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。

然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。

二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。

大鼠骨髓间充质干细胞安全操作及保养规程引言骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类多能干细胞，可以分化为多种细胞类型，具有广泛的应用前景。

然而，在实验室中进行大鼠骨髓间充质干细胞的操作和保养时，需要遵循一定的操作规程，以确保实验的安全性和可靠性。

本文将介绍大鼠骨髓间充质干细胞的安全操作及保养规程。

1. 实验操作安全要求在进行大鼠骨髓间充质干细胞的操作时，需要注意以下安全要求：•实验室应定期进行消毒，以保持实验环境的清洁。

•操作人员应佩戴防护手套、实验服和口罩，以防止污染和传播病原体。

•所用的实验器材、培养皿和培养介质等都需要提前消毒处理，以防止细菌和病毒的污染。

•操作过程中应注意避免直接接触大鼠骨髓，以防止伤口感染和交叉感染。

•实验后，实验器材和废弃物应进行妥善处理，以防止污染和传播病原体。

2. 大鼠骨髓间充质干细胞的保养大鼠骨髓间充质干细胞的保养是确保其活力和纯度的重要环节。

下面是大鼠骨髓间充质干细胞的保养规程：2.1 培养基的准备•准备鼠骨髓间充质干细胞培养基，包括DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素(PS)溶液。

•使用无菌技术将培养基分装到无菌的培养瓶或培养皿中，密封好并在4°C保存。

2.2 培养皿和培养环境的准备•选择合适的培养皿，如培养瓶、培养皿或培养板等。

建议使用无菌培养瓶，便于培养细胞和观察生长状态。

•将培养皿放入灭菌箱中进行灭菌处理，确保无菌环境。

•在培养实验室中，保持适宜的温度（37°C）和湿度以促进细胞生长。

2.3 细胞的传代与分裂•当细胞生长到80%～90%的密度时，即可进行传代和分裂。

•用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除残留培养基和杂质。

•加入适量的胰蛋白酶/EDTA溶液，并放置于37°C恒温培养箱中，使细胞分离。

•加入适量的完全培养基以停止胰蛋白酶的作用，并用显微镜观察细胞的分离情况。

大鼠骨髓基质细胞的培养周谊芬;董玉林【摘要】目的：探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法，观察骨髓基质细胞的形态。

方法：从SD大鼠中分离骨髓基质细胞，采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法将分离的骨髓基质细胞体外扩增，倒置显微镜下观察细胞形态学特征。

结果：倒置相差显微镜观察发现，接种后24 h内细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形。

48 h后贴壁细胞沿培养瓶壁伸展开，圆形，折光性强，细胞壁完整，胞核隐约可见，胞质丰富。

传至第5代MSCs纯度高，增殖能力旺盛，呈梭形或纺锤形的细胞，呈漩涡状、菊花状排列生长。

结论：骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得，传至第5代的骨髓基质细胞纯度高，密度梯度离心法结合贴壁筛选法可作为是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法。

%Objective:To investigate the isolate and culture method of bone marrow stromal cells (MSCs) in vitro, to observe the morphology of MSCs. Methods: MSCs from rat bone marrow were separated and purified by means of gradient centrifugation and adherence to the culture plastic, morphological characteristics of which were observed by Inverted mi-croscope. Results: MSCs were isolated and cultured in vitro with high purity and strong proliferative capacity, fusiform or spindle-shaped cells were swirling, and daisy-like arrangement of growth were observed. Conclusions: MSCs can be cul-tured in vitro, MSCs spread to the fifth generation of high purity, and the means of gradient centrifugation and adherence to the culture plastic can be used as an ideal MSCs culture method.【期刊名称】《交通医学》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】3页(P205-206,213)【关键词】骨髓基质细胞;密度梯度离心法;贴壁筛选法;大鼠【作者】周谊芬;董玉林【作者单位】南通大学医学院人体解剖学系，江苏226001;南通大学医学院人体解剖学系，江苏226001【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）是一种广泛存在于骨髓组织中而非造血的实质干细胞[1-2]。

大鼠骨髓间充质干细胞培养干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。

本实验根据骨髓中间充质干细胞的贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性用贴壁法将其分离开来，此方法得率高、操作简单、无需特殊试剂，已广泛应用于科研工作中。

一、实验前准备实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。

选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。

将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。

工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。

以75%酒精擦拭操作台和双手。

无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。

将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

二、全骨髓提取眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。

除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

用无菌PBS浸泡清洗。

眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。

直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

三、细胞制备吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于15 mL离心管中，1000 r/min室温离心5 min。