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大鼠骨髓内皮祖细胞 SPIO

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2011年3月第8卷第9期

·短篇论著·

CHINAMEDICALHERALD中国医药导报

EPCS是一类能分化成为血管内皮细胞的干细胞。1997年Asahara等[1]报道EPCS分离成功，并在体内证明其血管生成的能力。随后的研究显示这些细胞来源于骨髓，可特异性地向血管形成的部位（包括缺血组织及肿瘤微环境）归巢[2-4]，参与受损部位的血管发生和血管生成，而且很少整合至正常血

管组织内。越来越多的研究认为，EPCS可能会成为新一代理想的再生医学工具或者基因治疗肿瘤的载体，为靶向性治疗提供可能性。SPIO作为MR阴性标记物标记移植细胞，可以为EPCS移植的MRI示踪奠定基础。1材料与方法

1.1实验动物及试剂、仪器

SD大鼠，体重120～150g，雌雄不拘，清洁级，由山西医

科大学实验动物中心提供。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Schering公司，德国），淋巴细

大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测崔碧，李健丁，张瑞平山西医科大学第一医院影像科，山西太原030001

[摘要]目的：研究大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCS）的分离、培养、SPIO标记，SPIO对EPCS的

标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响，为进一步的实验研究奠定基础。方法：SD大鼠体重120～150g，采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠EPCS，采用25μg/mlSPIO对其标记，比较标记和未标记的EPCS。普鲁士蓝染色观察铁标记率，台盼蓝检测细胞活力，MTT法检测细胞增殖力，Calcein-AM/PI染色检测细胞活性及细胞膜完整性，AO/PI染色检测细胞凋亡率。结果：分离培养EPCS7～10d，细胞集落相互连接，呈典型的铺路石样外观。普鲁士兰染色显示SPIO（25μg/ml，24h）对细胞的标记率接近94%；比较SPIO标记及未标记的EPCS，细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%；MTT法检测两组间相比差异无统计意学义（P＞0.05）；Calcein-AM/PI染色检测细胞的活性和膜完整性，存活率分别为96%和97%；AO/PI染色两组细胞的凋亡率均为5%。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞，经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养。25μg/ml浓度的SPIO细胞标记率高，对细胞毒性小，且不影响EPCS的活力、增殖及凋亡。[关键词]内皮祖细胞；骨髓；超顺磁性氧化铁颗粒；标记

[中图分类号]R73-351[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）03（c）-033-04

RatboneendothelialprogenitorcellslabeledwithsuperparamagneticironoxideparticlesandthedetectionCUIBi,LIJianding,ZHANGRuipingDepartmentofRadiology,theFirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China[Abstract]Objective:Tostudytheisolation,culture,SPIOmarkoftheratbonemarrowprogenitorcells(endothelialprogenitorcells,EPCS),andobservewhetherthereisanyeffectoncellularviability,proliferationandapoptosis.whichlaythefoundationforfutureexperimentalstudies.Methods:TheEPCSwerecollectedfrombonemarrowofrats(weighing120-150g)andcultured.EPCSwereobtainedbydensitygradientcentrifugationandadhesive-screeningmethodsandlabeledwith25μg/mlSPIO.Markedandunlabeledgroupswerecompared.Prussianbluestainingwasusedtoidentifylabelingindex,Trypanbluestainingwasemployedtodetectcellvitality,MTTassaywasutilizedtodetectproliferationactivityofstemcells,Calcein-AM/PIstainingcellwasdetectedcellactivityandmembraneintegrity,AO/PIstainingwasdetectedcellapoptosis.Results:CellColonieswereconnected,showingthetypicalcobblestoneappearanceonthe7-10d.PrussianbluestainingshowedthatSPIO(25μg/ml,24h)ofcellslabeledrateofcloseto94%;comparedSPIOlabeledandunlabeledEPCS,cellviabilitywas94.34%±0.25%and95.33%±0.31%;MTTassaydetectedthattherewasnostatisticaldifferencebetweenthegroupscomparedwithItalyinrighteousness(P＞0.05);Calcein-AM/PIstainingcellactivityandmembraneintegrity,survivalrateswere96%and97%;AO/PIstainingcellswitheredgroupsdeathratewas5%.Conclusion:Gradientcentrifugationfrombonemarrowmononuclearcellscanbeachievedbyinductionofendothelialprogenitorcells,isolatedandcultured;25μg/mlhighconcentrationsofSPIOcelllabelingdosenotaffecttheEPCSviability,proliferationandapoptosis.[Keywords]Endothelialprogenitorcell;Bonemarrow;Superparamagneticironoxid;Labeling

[基金项目]山西医科大学青年科技研究基金（项目名称：SPIO标记干细

胞移植治疗兔脊髓损伤的MR活体示踪；项目编号：2010021038-2）。[作者简介]崔碧（1984-），女，山西医科大学2008级在读硕士；研究方

向：腹部影像。[通讯作者]李健丁（1951-），男，本科学历，山西医科大学第一医院影像

科主任，教授；研究方向：腹部影像。

33·短篇论著·2011年3月第8卷第9期

中国医药导报CHINAMEDICALHERALD胞分离液、台盼蓝、胰蛋白酶（Sigma公司，美国），DMEM/L（Hyclone公司，美国），FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司），VEGF，bFGF（Peprotech公司，英国），多聚甲醛（天津傲然精细化工研究所），钙黄绿素（Calcein-AM）、碘化丙啶（PI）（日本同仁化学研究所），倒置显微镜（Leica公司，德国），激光共聚焦显微镜（OLYMPUS，日本），CO2培养箱（SIM公司，美国）。1.2细胞的提取、分离与培养大鼠断颈处死后，置于75%酒精浸泡灭菌5min。无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨，去除肌肉组织，用注射器吸取PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，充分冲出骨髓组织后收集至离心管中。将冲洗液沿管壁缓缓加入盛有分离液的离心管内（两者体积比为1∶1），动作宜轻柔，勿使其与分离液混合，水平离心，2000r/min离心30min，将离心后的白雾状细胞层小心吸出来，用PBS液洗涤3次，应用DMEM/L培养基[含体积分数15%胎牛血清，bFGF和VEGF终浓度均为10ng/ml，青霉素（100U/ml），链霉素（0.1g/L）]，接种于预铺有纤连蛋白3.5cm培养皿中，置入在10％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中。72h后进行第1次半量换液，洗去未贴壁细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，以后根据培养基变化情况每2～3天全量换液。1.3EPCS的磁标及观察SPIO标记细胞，细胞培养8天，加入终浓度25μg/ml的SPIO，置于培养箱内孵育24h，用PBS洗涤3次，去除未进入细胞的铁离子。1.3.1标记率测定普鲁士蓝铁染色，细胞爬片后用4％多聚甲醛固定30min，倒掉后PBS冲洗3次，晾干后加入新鲜Perls溶液（A液：2%亚铁氰化钾；B液：2%盐酸；临用前A、B液等量混合，静置3min），置培养箱孵育30min，PBS冲洗3次，加入0.5%中性红水溶液对比染色10min，PBS洗涤3次。光镜下观察核呈红色，Fe3+呈蓝色，表明标记成功并计算胞浆内存在蓝色颗粒的细胞数量和比例。1.3.2台盼蓝染色检测细胞活力标记细胞消化离心后制成细胞悬液，取90μl悬液和10μl台盼蓝染液混匀，细胞计数板与盖玻片上、下两侧各加10μl混匀液，镜下观察，计数100个细胞，细胞活力=染色阴性细胞数/100个细胞×100%。未标记组方法同上，倒置显微镜下分别于细胞标记后7d行细胞活性检测。1.3.3MTT法检测细胞增殖力消化EPCS后接种于96孔板中，每孔体积200μl，细胞数为1×106个/ml。标记组和未标记组每组24孔细胞，以纯培养基空白对照，培养1、3、5、7d后相同时间每组各取6孔细胞，加入20μlMTT液（5g/L）孵育4h后，吸弃孔内培养基，向每孔加入200μl二甲基亚砜，轻轻振荡10min充分溶解细胞代谢产物，以空白孔调零后求出各孔吸光度值，用酶标仪检测590nm吸光度值A590。1.3.4AO/PI染色检测细胞凋亡率用10mlPBS溶解AO原粉100mg制备成1%的AO母液；1mlddH2O溶解1mgPI，制备成1.5mmol/L的PI储备液（1mgPI/1mlH2O）（-20℃下避光冷冻保存）。细胞染色前加1mlAO母液和1mlPI储备液至8mlPBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞，各培养皿中加入100μl染液，37℃温孵10min后，用PBS洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察，每皿随机取至少

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大鼠心脏血内皮祖细胞的分离培养、鉴定与分化

大鼠心脏血内皮祖细胞的分离培养、鉴定与分化


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ｌｎ ｎｕｙａｄ ｈ ｃ ｔ ｒｓｉ ｔｒ ｄｓ ｒｓ ｓｎ ｒｍｅ： ｆ ｉｏｓ ｕ ｇｉ ｒ ｎ ｔｅａｕｅ ｅｐｒ ｏ ｉ ｅｓ ｙｄｏ ｄ ｉ ｔ ｎ ｊ ａｙ ｔ ｅｎ ｉ
４参考 文献
１Ｖ ｎ — Ｈｅ ｅ Ｐ， ｕ ｐ ｒ ＷＣ ，ｔｅｖｏｄ ｎ Ｄｅ １ｎｒｔ ｃｅｌ ａ ｌ ｎ Ｈ Ｋ ｉ ｅｓ ｄ ｊ Ｓｅｎ ｏｒｅ ， ａ． ｔ ｒ ｈａ ｔ Ｉ ａａ
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江 西 医药 ２０ ０ ８年 第 ４ ３卷 第 １ Ｏ期
Ｉ一 、Ｌ １ Ｌ ６ Ｉ一 ０的浓 度显 著 升 高 ， 明 内毒素 入血 后 刺 表 激机 体产 生多种 炎性 介质 ．这些 介质通 过直 接或 间 接 的相 互 作用 ．产 生 炎 症 级 联 反 应 ．引起 Ａ ｌ Ｌ 或
大鼠骨髓原代巨噬细胞形态

大鼠骨髓原代巨噬细胞形态

大鼠骨髓原代巨噬细胞形态巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，它在机体的免疫防御中发挥着重要的作用。

大鼠骨髓原代巨噬细胞是一种来源于大鼠骨髓的原代细胞，研究该细胞的形态特征有助于深入了解其功能和生理过程。

大鼠骨髓原代巨噬细胞的形态特征主要包括细胞形状、大小、细胞器结构和特殊的细胞突起等。

正常情况下，大鼠骨髓原代巨噬细胞呈现为椭圆形或不规则形状，细胞大小约为10-30微米。

细胞质内可见到丰富的细胞器，如线粒体、内质网和高尔基体等。

此外，大鼠骨髓原代巨噬细胞表面常常具有许多细胞突起，这些突起有助于巨噬细胞与周围环境的物质进行接触和交流。

骨髓巨噬细胞的形态特征还与其活化状态密切相关。

在未受激活的状态下，大鼠骨髓原代巨噬细胞呈现为静止状态，细胞形状规则，细胞突起较少。

当受到外界刺激，如病原体感染或炎症反应，大鼠骨髓原代巨噬细胞会发生形态上的改变。

一方面，细胞体积会增大，细胞形状变得不规则，细胞膜上出现更多的细胞突起。

另一方面，巨噬细胞的细胞器结构也会发生变化，内质网增生、高尔基体扩张，线粒体数量增多。

这些形态上的改变反映了巨噬细胞活化状态下的生理功能的改变，如吞噬能力的增强和细胞因子的释放等。

大鼠骨髓原代巨噬细胞的形态特征还受到细胞培养条件的影响。

在体外培养中，巨噬细胞的形态可能会发生改变，细胞形状变得更加扁平，细胞突起的数量和长度也会受到不同因素的调节。

因此，在进行大鼠骨髓原代巨噬细胞的形态观察时，需要考虑到培养条件对细胞形态的影响，以及与体内细胞形态的差异。

大鼠骨髓原代巨噬细胞具有特定的形态特征，包括细胞形状、大小、细胞器结构和特殊的细胞突起等。

这些形态特征在巨噬细胞的功能和生理过程中起着重要的作用。

通过对大鼠骨髓原代巨噬细胞形态的观察，可以更加深入地了解巨噬细胞的结构和功能，为相关研究提供重要的参考依据。

大鼠周围神经损伤后外周血内皮祖细胞动员及相关因子含量变化

大鼠周围神经损伤后外周血内皮祖细胞动员及相关因子含量变化

实验研究大鼠周围神经损伤后外周血内皮祖细胞动员及相关因子含量变化赵斌，赵志虎，骆巍，马剑雄，马信龙△摘要：目的　探讨大鼠周围神经损伤（PNI）后外周血内皮祖细胞（EPCs）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平变化及EPCs与其他指标的相关性。

方法　42只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、PNI 1 d组、PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组，每组7只，除对照组外其余组均采用钳夹法建立坐骨神经损伤模型。

对每组在预定时间点采用活体心脏穿刺法采血；采用Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞，CD34和CD133双阳性细胞标记EPCs，应用流式细胞仪检测各组EPCs数量。

采用酶联免疫吸附试验检测各组外周血bFGF、VEGF及MMP-9含量，分析EPCs数量与bFGF、VEGF、MMP-9水平的相关性。

结果　与对照组相比，PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组外周血EPCs数量升高，PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组外周血bFGF含量升高，其余各组外周血VEGF含量升高，PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组外周血MMP-9含量升高（P＜0.05）。

PNI 5 d组和PNI 7 d组外周血EPCs数量与血清bFGF水平呈正相关（r分别为0.784和0.788，P＜0.05），与血清VEGF水平呈正相关（r分别为0.889和0.852，P＜0.05）；PNI 5 d组、PNI 7 d组和PNI 14 d组外周血EPCs数量与血清MMP-9水平呈正相关（r分别为0.788、0.852和0.873，P＜0.05）。

结论　EPCs与bFGF、VEGF和MMP-9共同参与了PNI后血供修复的病理生理过程。

关键词：周围神经损伤；坐骨神经；内皮祖细胞；基质金属蛋白酶9；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子中图分类号：R651.3 文献标志码：A DOI：10.11958/20231111Changes in peripheral blood endothelial progenitor cell mobilization and related factors afterperipheral nerve injury in ratsZHAO Bin, ZHAO Zhihu, LUO Wei, MA Jianxiong, MA Xinlong△Digital Orthopedic Technology Clinical Application Center, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China△Corresponding Author　E-mail:**********************Abstract: Objective　To study changes and correlation of peripheral bold endothelial progenitor cells (EPCs) and serum bFGF, VEGF and MMP-9 in rats with peripheral nerve injury (PNI). Methods　Forty-two SD rats were divided into the control group, the PNI 1 d group, the PNI 3 d group, the PNI 5 d group, the PNI 7 d group and the PNI 14 d group according to random number table method, with 7 rats in each group. The sciatic nerve injury model was established in all groups except the control group. In each group, blood samples were collected by living heart puncture at a predetermined time point. Mononuclear cells were extracted by Ficoll density gradient centrifugation. CD34 and CD133 double positive cells were labeled with EPCs, and the number of EPCs in each group was detected by flow cytometry. The contents of bFGF, VEGF and MMP-9 in peripheral blood of each group were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, and the correlation between the number of EPCs and bFGF, VEGF and MMP-9 was analyzed. Results　Compared with the control group, EPCs in peripheral blood were increased in the PNI 3 d group, the PNI 5 d group and PNI 7 d group. bFGF contents in peripheral blood were increased in the PNI 3 d group, the PNI 5 d group, the PNI 7 d group and the PNI 14 d group, and VEGF contents in peripheral blood were increased in the other groups. The content of MMP-9 in peripheral blood was increased in the PNI 5 d group, the PNI 7 d group and the PNI 14 d group (P＜0.05). The number of EPCs in peripheral blood in the PNI 5 d group and the PNI 7 d group was positively correlated with serum bFGF level (r=0.784 and 0.788, P＜0.05) and serum VEGF level (r=0.889 and 0.852, P＜0.05). The number of EPCs in peripheral blood of the PNI 5 d group, the PNI 7 d group and the PNI 14 d group was positively correlated with serum MMP-9 level (r=0.788, 0.852 and 0.873, P＜0.05), and it was positively correlated with serum VEGF level (r=0.889 and 0.852, P＜0.05). The number of EPCs in 基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81501061）；天津市卫生健康行业高层次人才选拔培养工程-青年医学新锐（TJSQNYXXR-D2-136）；天津市卫生健康科研项目（TJWJ2023QN049） 作者单位：天津市天津医院数字骨科技术临床应用中心（邮编300211） 作者简介：赵斌（1988），男，副主任医师，主要从事骨科及周围神经损伤修复方面研究。

大鼠血管内皮祖细胞培养及鉴定

大鼠血管内皮祖细胞培养及鉴定

ｂ ｎ ｒ ｏ ｉ ａ ｓ Ｍ ｅｈ ｄ ＥＰ ｒ ｓ ｌｔ ｄ ｆ ｏ ｍａｅ Ｓ ｒ ｇ ｅ—Ｄａ ｅ ａ ｙ Ｆｉｏ ｌｄ ｎ ｉ ｒ ｄ ｅ ｔ ｃ ｎ ｒ ｕ ａ ｉｎ Ｄｉｃ ｏ ｅ ｍａ ｒ ｗ ｎ ｒ ｔ． ｔｏ ｓ Ｃｓ ｗｅ ｅ ｉｏ ａ ｅ ｒ ｍ ｌ ｐ ａ ｕ ｗｌｙ ｒ ｔｂ ｃ ｌ ｅ ｓｔ ｇ ａ ｉ ｎ ｅ ｔ ｉ ｇ ｔ ． ｓ ｓ ｙ ｆ ｏ
中西 医 结 合 心 脑 血 管 病 杂 志 ２ １ ０ ０年 ５月 第 ８ 第 ５期 卷
・５ ３ ６ ・
大 鼠血 管 内皮 祖 细 胞 培 养 及 鉴 定 Ｄ
朱
摘要 ： 的 目
江 ， 煜 敏 ， 朝红 ， 文 欣 刘 孔 道
探 索 骨 髓 来 源 的 血 管 内 皮祖 细 胞 的 分 离培 养 方 法 ， 缺 血 性 疾病 治 疗 找 到 新 的 移 植 细 胞 来 源 。 方 法 采 集 Ｓ 雄 为 Ｄ
组 经过 ＣＤ３ ４免 疫 荧 光 、 ＣＤ１ ３、 ３ ＦＬＫ一１免 疫 组 化 鉴 定 呈 阳 性 ， 能特 异 性 吸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ附 Ｆ ＴＣ—ＵＥ 一 内吞 ＤＩ 并 Ｉ Ａ 和 Ｉ 一Ａｃ —ＬＤＬ。 结 论 自体
骨髓 细胞 通 过 贴壁 换 液后 可 以分 离培 养 出 内皮祖 细 胞 ， 贴 壁 细 胞 经 过 体 外 诱 导后 大 量 扩 增 ， 通 过 表 面 标 记 物 鉴 定 可 以确 认 为 内 取 并 皮 祖 细 胞 ， 非 贴 壁 细 胞 不 能 大 量增 殖 ， 将 贴 壁 分 离方 法 来 筛选 内皮 祖 细胞 ， 方 法 简 易 ， 能 满 足 细 胞 移 植 的 需要 ， 而 故 此 并 因而 ， 移 植 在 治 疗 脑 缺 血 引起 的 内皮损 伤 应 该 有 较 好 的 临床 应 用 前 景 。