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大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定韩玮;苏力担卡扎·仇曼;何铁英;程坤;郝晓文;王松;陈启龙【摘要】目的：探索大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的分离、培养及鉴定方法。
方法采用贴壁分离方法，分离纯化3～4周龄 SD 大鼠的骨髓间充质干细胞，观察细胞生长状况，分别用免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核的方法鉴定 BMSCs 纯度及活性。
结果原代 BMSCs 呈圆形、大小均一，透光性可，24 h 后开始贴壁，2 d 后开始长出伪足，7～8 d 细胞融合达90％，纯化后 BMSCs 呈梭形，24 h 细胞贴壁率可达99％，前4代细胞传代周期为7 d，之后传代周期逐渐缩短。
第3代BMSCs 的表面标志物 CD29阳性表达率为98．9％，CD44阳性表达率为73．3％。
DAPI 标记的 BMSCs 胞核可见明亮蓝色荧光，标记率达100％。
结论贴壁分离法分离大鼠 BMSCs，可得到纯度较高、活力强的 BMSCs，第3代BMSCs 生物学性状稳定。
%Objective To explore the methods of separate,culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Methods By adherent separation method,bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified from 3-4 weeks old SD rat,then cell growth was observed,respectively by im-munofluorescence staining,flow cytometry and DAPI nuclear staining method for identification of BMSCs purity and activity.Results Primary BMSCs was round,uniform in size and light in transmission.After 24h begin to adherent,2 d began to grow following pseudopodia,90% of the cells were fused on 7-8 d, and purified BMSCs werefusiform.24 h cell adherent rate was 99% and before the 4th generation cell cycle was 7 days.After subculture,cycle graduallyshortened.The results of surface markers of the third gener-ation MSCs showed thatthe positive rate of CD29 was 98.9%,and the positive rate of CD44 was 73.3%. DAPI labeled BMSCs,the nucleus can see bright blue fluorescence,labeling rate of 100%.Conclusion Adherent separation of rat BMSCs have high purity and strong vitality of BMSCs,and the third generation of BMSCs shows stable biological character.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2016(039)009【总页数】4页(P1155-1158)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;大鼠【作者】韩玮;苏力担卡扎·仇曼;何铁英;程坤;郝晓文;王松;陈启龙【作者单位】新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054【正文语种】中文【中图分类】R33骨髓间充质干细胞(BMSCs)为非造血干细胞，存在于骨髓中，易于获得及分离培养，可诱导为多重细胞，分泌多重生长因子、酶及趋化因子，在组织器官的修复及促进组织器官生长过程中起到关键作用[1]。
大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定作者：李兰兰陈玲肖马炬明来源：《中国现代医生》2014年第01期[摘要] 目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养方法。
方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。
结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。
生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02% P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。
BMSCs 高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。
成脂诱导21 d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。
成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。
结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。
[关键词] 骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0007-04BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点[1-2]，使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。
但是骨髓中的间充质干细胞含量极低[3]，且其含量随年龄增长而逐渐减少[4]，需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。
实验旨在建立一套简便有效的BMSCs原代培养方法，为后续实验做好准备。
1 材料与方法1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100 g，由浙江省实验动物中心提供。
实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 时间及地点于2013年1～6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。
1.3 实验主要试剂低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素（吉诺生物），优质胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen公司）。
应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究卢宁;赵龙凤;李红;郝彦琴;黄丽丽【摘要】目的探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45.结果获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期.细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/C1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性.结论体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2010(041)003【总页数】5页(P277-280,封3)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;全骨髓贴壁法【作者】卢宁;赵龙凤;李红;郝彦琴;黄丽丽【作者单位】山西医科大学第一临床医学院感染科,太原,030001;山西医科大学第一临床医学院感染科,太原,030001;山西医科大学第一临床医学院感染科,太原,030001;山西医科大学第一临床医学院感染科,太原,030001;山西医科大学第一临床医学院感染科,太原,030001【正文语种】中文【中图分类】Q813骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其具有强大的多向分化潜能及自我更新能力,且由于其易于分离培养扩增的特性而日益受到关注[1-3]。
但骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)含量极低,每 10万个单个核细胞中大约只有 1个 MSC[3]。
因而,本实验旨在探讨适宜的方法在体外获得大量优质的 BMSCs,以使其更好地服务于基础及临床研究。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
大鼠骨髓间充质干细胞培养
干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。
骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。
源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。
本实验根据骨髓中间充质干细胞的贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性用贴壁法将其分离开来，此方法得率高、操作简单、无需特殊试剂，已广泛应用于科研工作中。
一、实验前准备
实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。
将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。
工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。
以75%酒精擦拭操作台和双手。
无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。
将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。
二、全骨髓提取
眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。
除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。
假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。
用无菌PBS浸泡清洗。
眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。
直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。
三、细胞制备
吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于15 mL离心管中，1000 r/min室温离心
5 min。
四、接种培养
离心后去上清，用6mL完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至25 cm2培养瓶中，轻轻摇匀；置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。
24小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。
换液，去除漂浮的血细胞，以后每两三天换液1次，直到增殖达到融合。
约7天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达80%~90%，可进行细胞传代。
五、细胞传代
待细胞融合至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS轻轻冲洗后，吸去PBS。
采用消化液消化1-2分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。
本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。
除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。
本实验以1：2进行传代。
六、细胞观察
细胞传代到第3代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达95%以上。
此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34阴性，CD44阳性。
从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。
七、注意事项
1、缓慢冲洗骨髓腔：
冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。
2、严格无菌：
取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作
3、培养基中血清浓度：
过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。
而且一般来说，选择质量好10%的胎牛血清最有利于MSCs的培养
4、原代细胞静置培养：
原代细胞置于培养箱24～48h内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。
