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大鼠骨髓原代巨噬细胞形态巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，它在机体的免疫防御中发挥着重要的作用。
大鼠骨髓原代巨噬细胞是一种来源于大鼠骨髓的原代细胞，研究该细胞的形态特征有助于深入了解其功能和生理过程。
大鼠骨髓原代巨噬细胞的形态特征主要包括细胞形状、大小、细胞器结构和特殊的细胞突起等。
正常情况下，大鼠骨髓原代巨噬细胞呈现为椭圆形或不规则形状，细胞大小约为10-30微米。
细胞质内可见到丰富的细胞器，如线粒体、内质网和高尔基体等。
此外，大鼠骨髓原代巨噬细胞表面常常具有许多细胞突起，这些突起有助于巨噬细胞与周围环境的物质进行接触和交流。
骨髓巨噬细胞的形态特征还与其活化状态密切相关。
在未受激活的状态下，大鼠骨髓原代巨噬细胞呈现为静止状态，细胞形状规则，细胞突起较少。
当受到外界刺激，如病原体感染或炎症反应，大鼠骨髓原代巨噬细胞会发生形态上的改变。
一方面，细胞体积会增大，细胞形状变得不规则，细胞膜上出现更多的细胞突起。
另一方面，巨噬细胞的细胞器结构也会发生变化，内质网增生、高尔基体扩张，线粒体数量增多。
这些形态上的改变反映了巨噬细胞活化状态下的生理功能的改变，如吞噬能力的增强和细胞因子的释放等。
大鼠骨髓原代巨噬细胞的形态特征还受到细胞培养条件的影响。
在体外培养中，巨噬细胞的形态可能会发生改变，细胞形状变得更加扁平，细胞突起的数量和长度也会受到不同因素的调节。
因此，在进行大鼠骨髓原代巨噬细胞的形态观察时，需要考虑到培养条件对细胞形态的影响，以及与体内细胞形态的差异。
大鼠骨髓原代巨噬细胞具有特定的形态特征，包括细胞形状、大小、细胞器结构和特殊的细胞突起等。
这些形态特征在巨噬细胞的功能和生理过程中起着重要的作用。
通过对大鼠骨髓原代巨噬细胞形态的观察，可以更加深入地了解巨噬细胞的结构和功能，为相关研究提供重要的参考依据。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定燕学波;杜运华;吕安林;邢玉洁;胡朝晖;胡新君;岳峰【摘要】目的研究大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法.方法采用颈椎脱臼法处死大鼠,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出骨髓间充质干细胞.然后通过换液培养去除悬浮不贴壁的细胞.待原代细胞长满培养瓶底85%左右时传代.倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原 CD44、CD45表达情况.结果在倒置显微镜下,刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形或球形,体积小,折光性强.3 d 后大部分细胞贴壁,体积较小,形态多样,为椭圆形、短梭形.2周形成集落,细胞数量明显增多,体积增大,以长梭形为主,呈放射状向四周扩展.传代后细胞生长旺盛,呈长梭形、旋涡状生长,且细胞形态均一,趋向一致.流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞表面抗原 CD44阳性表达率为(89.98±1.29)%,CD45阳性表达率为(2.14±0.22)%.结论联合细胞形态学变化及细胞表面标记抗原 CD44和 CD45的鉴定,采用密度梯度离心法联合差速贴壁法能够获得纯化的大鼠骨髓间充质干细胞.% Objective To investigate isolation, culture and identification of rat BMMSCs. Methods Rats were killed by cervical dislocation, BMMSCs were isolated from bone marrow of SD rats by density gradient centrifugation. Other cells mixed in BMMSCs were removed by differential adhesion method, then the purified BMMSCs were obtained. The cells grown to 85 % confluence were digested and passaged at the ratio of 1:2 till fourth passage in vitro. The morphological changes were observed under phase contrast microscope during the culture and passage of BMMSCs.The positive surface marker CD44 and negative marker CD45 of cells were detected for the identification of BMMSCs withflow cytometry. Results Primary BMMSCs were smaller and had varied shapes, most of cells were of oval or short spindle and had strong refraction. The majority adhered after 3 d, and the cells showed morphological diversity ranging from oval, short spindle, to triangular or star-shaped. After 2 w, the adherent cells rapidly proliferated and formed large or small colonies. After passage, the cells were larger than the original cells and showed elongated spindle, arranged the same trend. The results of flow cytometry showed that CD44 expression of BMMSCs was (89.98±1.29)%, CD45 positive expression rate was (2.14±0.22)%. Conclusion The purified BMMSCs were obtained by density gradient centrifugation combined differential adhesion method. The purified BMMSCs could be identified by detecting positive surface antigen CD44 and negative surface antigen CD45.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2012(000)010【总页数】3页(P931-933)【关键词】骨髓间充质干细胞;CD44;CD45;分离;鉴定【作者】燕学波;杜运华;吕安林;邢玉洁;胡朝晖;胡新君;岳峰【作者单位】河南信阳，154 医院心肾内科;河南信阳，154 医院心肾内科;陕西西安，解放军第四军医大学西京医院心内科;陕西西安，解放军第四军医大学西京医院心内科;河南信阳，154 医院心肾内科;河南信阳，154 医院心肾内科;河南信阳，154 医院心肾内科【正文语种】中文【中图分类】Q2-33近几年自体骨髓间充质干细胞（BMMSCs）移植技术发展迅速，逐渐成为治疗心肌梗死后心衰的有效办法之一。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
4032 ｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞增殖、凋亡及吞噬能力的影响李 莉1，2，卓 瑾1，2，郑 玲3，周 玲4，王启松1，2，罗 岚2，骆 凯2文题释义：骨髓源性巨噬细胞：人骨髓来源巨噬细胞分离自骨髓，骨髓细胞中存在未分化的巨噬细胞前体，通过加入巨噬细胞集落刺激因子来分化培养出巨噬细胞。
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在适宜条件下可生活两三周，多用做原代培养，难以长期生存。
吞噬作用：高等动物具有一些特化的吞噬细胞，包括巨噬细胞和中性粒细胞。
它们通过吞噬菌体摄取和消灭感染的细菌、病毒、损伤的细胞、衰老的红细胞。
吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。
对于其要消灭的对象无特异性，在免疫学中称之为非特异性免疫作用。
摘要背景：经典激活巨噬细胞和替代激活巨噬细胞具有不同的表型和功能，目前尚鲜有研究探讨不同诱导方式对骨髓来源巨噬细胞生物学功能的影响。
目的：探讨不同诱导极化方式对大鼠骨髓来源巨噬细胞生物学行为的影响。
方法：通过原代细胞形态学观察、瑞氏染色和流式细胞术对体外分离培养的大鼠骨髓来源巨噬细胞进行鉴定。
经γ-干扰素和脂多糖、白细胞介素4分别诱导激活24 h ，倒置显微镜观察细胞形态，Real time-PCR 检测细胞表面标记物Nos2和Arg1的表达，CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡水平，中性红染色鉴定细胞吞噬功能。
结果与结论：经γ-干扰素和脂多糖联合刺激的骨髓来源巨噬细胞高表达M1型细胞表面标记物Nos2，可促进细胞凋亡并且降低细胞的吞噬功能；而经白细胞介素4刺激的骨髓来源巨噬细胞则高表达M2型细胞表面标记物Arg1，提高细胞增殖和吞噬能力，抑制细胞凋亡。
结果表明，不同诱导极化方式可影响骨髓来源巨噬细胞的生物学行为。
关键词：骨髓；巨噬细胞；1型巨噬细胞；2型巨噬细胞；极化；γ-干扰素；脂多糖；白细胞介素4 缩略语：骨髓来源巨噬细胞：bone marrow-derived macrophages ，BMMsEffects of different induced polarization methods on the proliferation, apoptosis and phagocytosis of rat bone marrow-derived macrophagesLi Li 1, 2, Zhuo Jin 1, 2, Zheng Ling 3, Zhou Ling 4, Wang Qisong 1, 2, Luo Lan 2, Luo Kai 21Fujian Key Laboratory of Oral Diseases & Fujian Provincial Engineering Research Center of Oral Biomaterial & Stomatological Key Laboratory of Fujian College and University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China; 2Institute of Stomatology, Fujian Medical University & Center of Oral Tissue Engineering, Fujian Medical University & Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China; 3Fujian Armed Police Corps Hospital, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 4Fujian Provincial Governmental Hospital, Fuzhou 350003, Fujian Province, Chinahttps:///10.12307.2021.016投稿日期：2020-07-13送审日期：2020-07-13采用日期：2020-08-22在线日期：2020-12-31中图分类号： R459.9；R394.2；R318文章编号：2095-4344(2021)25-04032-06文献标识码：B1福建省口腔疾病研究重点实验室，福建省口腔生物材料工程技术研究中心，福建省高校口腔医学重点实验室，福建省福州市 350002；2福建医科大学口腔医学研究院，福建医科大学口腔组织工程研究中心，福建医科大学附属口腔医院，福建省福州市 350002；3福建武警总队医院，福建省福州市 350003；4福建省级机关医院，福建省福州市 350003第一作者：李莉，女，1994年生，福建省尤溪县人，汉族，博士研究生，主要从事牙周病方面的研究。
bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。
它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。
下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。
1. 材料准备。
常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。
2. 培养骨髓细胞。
首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。
通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。
3. 培养和分化。
将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。
细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。
4. 细胞纯化。
有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。
总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。
同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。
希望以上信息能够对你有所帮助。
大鼠骨髓间充质干细胞分离操作方法
（1）取SD大鼠（2周龄），颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。
（3）从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。
（4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL 离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。
（5）2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨髓基质细胞层（白色浑浊状），PBS洗三次。
（6）用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
（7）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。
以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。
（8）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。
细胞形态
骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。
换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。
传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是心脏组织中最主要的细胞类型，其具有重要的研究价值和应用前景。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和技巧，以供需要的研究者参考。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 质子化心肌细胞将雄性大鼠（体重200-250g）置于无菌条件下，去毛、消毒，然后迅速取出心脏，置于含有生理盐水的培养皿中。
使用显微镊子和显微刀将心脏分割成小块，使得心肌组织充分暴露。
将小块心肌组织转移至含有0.05%的胰酶和0.1%的胰蛋白酶的新鲜培养液中，温育30分钟至1小时。
温育完成后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗心肌组织，过滤去除残留的纤维和细胞碎片。
对心肌组织进行胶原酶-胰蛋白酶消化，离心沉淀后获取心肌细胞。
2. 分离和纯化获得的心肌细胞需要经过一定的分离和纯化步骤，以消除其他非心肌细胞的干扰。
常用的分离方法包括稳定梯度离心法、摇床培养法和免疫分选法。
通过适当的分离方法，可以获得较为纯净的大鼠心肌细胞用于后续研究。
1. 形态学鉴定通过显微镜观察大鼠心肌细胞的形态结构，包括细胞形状、大小、核与细胞浆的比例等，进行初步的鉴定。
正常的心肌细胞呈长条状，具有跨膜结构，胞质内含有丰富的线粒体和肌纤维等特征。
2. 免疫细胞化学鉴定通过特异性抗体对心肌细胞进行染色和标记，观察其对特定标记蛋白的表达情况。
常用的标记蛋白包括肌动蛋白、肌球蛋白、心肌肌球蛋白等。
通过免疫细胞化学鉴定，可以明确心肌细胞的特异性。
1. 培养基的选择大鼠心肌细胞的培养通常选用DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）培养基，添加10%的胎牛血清和适量的抗生素。
培养基的pH值应调整在7.2-7.4之间，以及含有必要的营养物质和生长因子。
2. 细胞密度和培养条件将鉴定过的心肌细胞悬浮于培养基中，调整成合适的细胞密度后，接种于预先涂覆明胶质或明胶胱聚糖混合物的培养皿中。
巨噬细胞培养操作方法
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分
子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代
培养，难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、 S774A.1、RAW 309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代
和瓶壁分离，但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材
法最为实用，其法如下：
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。
2、引颈处死小鼠。
3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中 3－5秒。
4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及
腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时
用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。
6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取
入针管内。
7、小心拔出针头，把液体注入离心管。
8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。
9、计数细胞。
每只鼠可产生20一30×106细胞，其中 90%为巨噬细胞。
10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。
11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定李静,王亚平(重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016)=摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。
方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。
采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。
结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。
=关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定=中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24Methodology of separation,purification,cultivation an didentification of rat bone marrow macrophageLI Jing,et al(Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage.=Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification巨噬细胞是机体的重要防御细胞。
大量研究已证明[1,2],巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。
深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。
深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心作者介绍:李静(1973-),女,讲师,硕士,主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。
问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。
尽管国内外不少文献报道[3,4]已能从多种组织和器官中分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。
为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。
1材料与方法1.1大鼠骨髓细胞(rat bone marrow cell,rBM C)8~12周龄Wistar大鼠,雄性和雌性各半,体重200~ 250g(重庆医科大学实验动物中心提供)。
断头处死,消毒条件下,取出完整股骨,用7号针头在股骨的两端打孔,R PM I -1640培养液冲出全部骨髓细胞,过4号针头制成单细胞悬液,离心洗涤后,计数BM C数,调整细胞至所需浓度。
1.2L929培养上清(L929conditio ned media,L929-CM)制备L929细胞株(本校肝炎研究所提供)在含10%小牛血清,青链霉素(100U/ml)的RPM I-1640培养液中常规培养3天,收集上清液,离心,-20e冰箱保存备用。
1.3大鼠骨髓巨噬细胞的分离、培养取大鼠骨髓细胞(rBM C),用含20%马血清,20%L929-CM(v/v)的DM EM培养液调整细胞浓度为1@106/ml,按4ml/孔接种于无菌六孔塑料培养板中(先在培养板孔内放置2.5cm@2cm的长方形血盖片),置37e、含5%CO2培养箱中培养4天,换液去除悬浮细胞,继续加入同种培养液培养3天后,可见培养板底部血盖片上逐步铺满了椭圆形的细胞。
1.4培养细胞的形态学检查1.4.1倒置显微镜观察在种植BM C后的1~4天分别观察贴壁细胞形态。
1.4.2光学显微镜检查取已铺满细胞的血盖片,清水冲洗去掉表面的悬浮细胞,晾干后进行Wr ight c s染色,光学显微镜下观察。
1.4.3电子显微镜检查用橡皮刮将血盖片上的细胞刮下,离心洗涤后,用2.5%戊二醛固定。
按常规方法制备半薄切片、超薄切片,H600型透射电子显微镜观察、摄片。
1.5细胞吞噬功能检测1.5.1墨汁吞噬试验[5]待贴壁细胞铺满皿底时,在培养体系中加入10%墨汁0.05ml,培养箱中孵育3h,取出血盖片,用等渗液洗去悬浮的墨汁颗粒,晾干,Wr ight c s染色,镜下计数200个细胞,计算其吞噬率及吞噬指数。
1.5.2鸡红细胞吞噬试验[6]待贴壁细胞铺满皿底时,在培养体系中加入鸡红细胞悬液0.1ml,培养箱中孵育1~3.5h,取出血盖片,用等渗液洗去浮在上面的红细胞,晾干, Wrig ht c染色。
油镜下计数200个细胞,记录吞有鸡红细胞的细胞数,并鉴定吞噬级别、吞噬指数、吞噬率。
1.6细胞的酶化学检测1.6.1酸性磷酸酶染色[7]按Gomori硫化铅染色法进行,阳性反应为棕黄色或棕黑色颗粒或片块状沉淀,定位于细胞胞浆中。
光镜下每张载片计数200个细胞,计数5张载片,求出阳性率。
1.6.2A-醋酸萘酚酯酶染色(A-A NE)[5]细胞浆内有棕黑色沉淀为酯酶阳性,浆内无沉淀者为阴性。
光镜下每张载片计数200个细胞,计数5张载片,求出阳性率。
1.7免疫细胞化学检测CD68表达采用SP免疫细胞化学法检测细胞表面标志CD68的表达。
并设置不加一抗的阴性对照。
阳性细胞染色位于细胞膜,呈棕黄色颗粒状。
在光镜下每张载片计数300个细胞,计算CD68表达阳性细胞。
1.8实验数据的统计学处理所获实验数据均输入计算机,经SAS统计软件进行直线相关回归分析,方差分析和t检验。
2结果2.1培养细胞的形态学观察培养48h后,可观察到呈椭圆形、三角形或不规则形的贴壁细胞,胞浆丰富,6~7天时,细胞贴满培养板底的血盖片,细胞呈星形,有许多伪足和突起。
Wrig ht c s染色光镜观察,可见细胞形状多样,界限清楚,有钝圆形突起。
胞浆丰富,富含颗粒及少许空泡。
核为卵圆形、肾形或不规则形,偏居于细胞的一端,着色较深,异染色质颗粒分散在核内或依附在核膜的内面,有1~2个核仁(图1)。
图1骨髓巨噬细胞(瑞氏染色,@400)图2骨髓巨噬细胞(@600)图3 骨髓巨噬细胞墨汁吞噬实验(@400)图4 骨髓巨噬细胞鸡红细胞吞噬实验(瑞氏染色,@1000)图5 骨髓巨噬细胞ACP 染色阳性(@400)图6 骨髓巨噬细胞A -NAE 染色阳性(@1000)图7 骨髓巨噬细胞CD 68阳性表达(I CC,@400)电子显微镜下可见细胞外形不规则,细胞表面有许多微皱褶、不规则的微绒毛和少数球形隆起,细胞核呈卵圆形或马蹄形,异染色质呈小块状,多沿核膜内面分布。
细胞质丰富,内有大量溶酶体,线粒体,吞噬颗粒,游离核糖体和少量内质网等(图2)。
2.2 培养细胞的鉴定将培养生长7天的细胞作吞噬试验,发现其对墨汁颗粒及鸡红细胞均有很强的吞噬作用:酸性磷酸酶及非特异性酯酶的阳性率也很高:巨噬细胞特异性的表面抗原CD 68的表达也呈阳性反应(表1、2,图3~7)。
表1 培养细胞的吞噬功能检测吞噬率(%)( x ?s )吞噬指数( x ?s )墨汁吞噬试验93.67?0.58207?19.00鸡红细胞吞噬试验86.20?1.92129.40?14.91表2 培养细胞的ACP,A -A NE,和CD 68表达酸性磷酸酶染色(ACP)非特异性酯酶染色(A -ANE)CD 68免疫细胞化学染色(CD 68ICC)阳性率(%)( x ?s )88.67?0.5885.67?1.5883.67?1.533 讨 论粒细胞与单核巨噬细胞起源于粒-单核系造血祖细胞(CFU -GM),CFU -GM 在体外培养体系中可形成粒细胞集落(CFU -G),巨噬细胞集落(CFU -M )或粒细胞与巨噬细胞的混合集落(CFU -GM )。
