1.丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂的研制及初步应用

丙肝病毒核心抗原检测的临床应用【摘要】目的探讨丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫吸附试验检测方法的临床应用价值。

方法对HCV-RNA阳性标本120份、阴性标本50份分别检测丙型肝炎病毒核心抗原和丙型肝炎病毒抗体。

结果以HCV-RNA结果为标准，丙型肝炎病毒核心抗原检测的灵敏度为97.5%，特异度为98%；丙型肝炎病毒抗体检测的灵敏度为80%，特异度为96%。

结论丙型肝炎病毒核心抗原检测方法能有效缩短窗口期、敏感性及特异性好、费用低、操作方便，对丙型肝炎病毒感染的辅助诊断具有重要意义。

【关键词】丙型肝炎；酶联免疫吸附法病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的严重危害人类健康的传染性疾病，最常见的是乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎，目前尚无有效的治疗方法。

据全国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗HCV阳性率3.2%，约3800万人感染丙肝病毒，HCV引起的肝炎约80%发展为慢性肝炎，对人类健康危害极大，疫苗的研制困难重重[1]。

因此尽早检出HCV感染者，阻断HCV传播是当务之急。

目前实验室检测丙型肝炎病毒的主要方法酶联免疫吸附法检测丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)，但是抗-HCV在HCV感染后6~12周出现，抗-HCV阴性不能排除窗口期感染。

丙型肝炎病毒核心抗原检测，可将窗口期缩短到15 d[2]。

本文对170例标本进行丙型肝炎病毒核心抗原检测，结果报告如下。

1 资料与方法1.1 标本来源所有标本均来自本院门诊及住院患者，其中HCV-RNA阳性标本120份，HCV-RNA阴性标本50份。

1.2 仪器与试剂丙肝抗原及丙肝抗体检测使用郑州安图公司PHOMO酶标仪及美国STAT-FAX2600洗板机。

其中丙肝核心抗原检测采用湖南景达公司生产试剂盒、丙肝抗体检测采用上海荣盛公司生产试剂盒，HCV-RNA检测使用美国ABI7500 基因扩增仪，试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的HCV-RNA核酸扩增荧光检测试剂盒。

1.3 方法所有标本均经过HBV-RNA检测,丙肝核心抗原检测，丙肝抗体检测。

丙型肝炎的检测方法与技术进展丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（HCV）引起的肝脏疾病，全球范围内影响着众多人的健康。

及时准确的检测对于丙型肝炎的诊断、治疗和预防具有至关重要的意义。

随着科学技术的不断发展，丙型肝炎的检测方法和技术也在不断进步和完善。

一、丙型肝炎病毒抗体检测这是最常见的初步筛查方法之一。

通过检测血液中是否存在针对HCV 的抗体来判断是否感染。

酶联免疫吸附试验（ELISA）和化学发光免疫分析法（CLIA）是常用的检测技术。

ELISA 法具有操作简单、成本较低的优点，但敏感性和特异性相对有限。

CLIA 法则在敏感性和特异性方面有了显著提高，能够更准确地检测出抗体。

不过，抗体检测存在一定的局限性。

例如，在感染后的“窗口期”，可能还未产生可检测到的抗体，从而导致假阴性结果。

此外，抗体检测无法区分是现症感染还是既往感染。

二、丙型肝炎病毒核酸检测核酸检测直接检测血液中的 HCV RNA，能够更早地发现感染，缩短“窗口期”。

实时荧光定量聚合酶链反应（RTPCR）是常用的核酸检测方法之一。

RTPCR 具有高度的敏感性和特异性，能够定量检测病毒载量，对于判断疾病的进展、治疗效果的监测以及评估是否治愈具有重要意义。

然而，该方法对实验条件和操作人员的技术要求较高，检测成本也相对较高。

三、丙型肝炎病毒基因分型检测了解 HCV 的基因型对于选择合适的治疗方案至关重要。

基因测序法是确定基因型的金标准，但操作复杂、成本高。

近年来，基于核酸检测的基因分型方法逐渐得到应用，如线性探针反向杂交法和基因芯片法。

这些方法相对简便、快速，能够满足临床对基因分型的需求。

四、丙型肝炎核心抗原检测HCV 核心抗原是病毒复制的指标之一。

检测核心抗原可以作为核酸检测的补充，尤其是在核酸检测条件受限的情况下。

但核心抗原检测的敏感性不如核酸检测，可能会出现漏检。

不过，其与抗体检测联合应用，可以提高检测的准确性。

五、检测技术的新进展（一）数字 PCR 技术数字 PCR 是一种新型的核酸定量检测技术，具有更高的准确性和灵敏度，能够检测到更低浓度的病毒核酸，对于低病毒载量的检测和微量残留病毒的监测具有优势。

丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况（综述）张贺秋丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染引起的一种重要的世界性传染病。

一般地，15~20%左右的HCV感染者为自限性感染，可以很快的康复。

但是，也有80~85%的感染者发展为慢性丙型肝炎，其中又有20%的可发展为肝纤维化，最终有4~5%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。

目前，慢性丙型肝炎除了干扰素有确切的疗效外，尚无其它有效的治疗药物。

国际上近来报道，PEG修饰的干扰素加利巴韦林联合治疗可在40~50%左右的患者获得较好的反应，但也有疗程长、价格昂贵、毒副作用大以及易反弹等缺点。

此外，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV高度变异而困难重重，短期内难有突破性进展。

因此，尽早检出HCV感染者，阻断HCV的传播是当务之急。

1 HCV检测技术的现状HCV一般通过被HCV污染的血液和血液制品传播，现在常用的HCV检测技术有两种方式：（1）间接检测，主要检测抗HCV抗体；（2）直接检测，通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分确定病毒的存在，例如HCV RNA。

这两种检测方式在确诊HCV感染，选择HCV感染者的治疗方案以及评价抗HCV 治疗的疗效方面起到了关键作用。

1.1 抗HCV抗体的检测上世纪九十年代初，利用重组HCV抗原开发出了抗HCV抗体检测技术，即酶免疫分析（enzyme immunoassays, EIAs）技术，已经发展到第三代。

该技术可检测样本中针对不同HCV抗原（如C区、NS3区、NS4区和NS5区等）的混合抗体，目前检测的特异性已高达99%以上。

由于缺乏更敏感的金标准，抗HCV EIA技术的敏感性还很难确定。

在免疫健全的患者中，抗HCV EIA的检测敏感性高于99%，几乎所有的HCV感染者都可以被检测出来。

但对于正进行血液透析的患者和严重免疫缺损患者，虽然其体内有HCV复制活跃，但EIA检测可能就是阴性结果。

丙型肝炎病毒核心抗原酶标抗体的制备及ELISA检测方法的建立将抗丙型肝炎病毒核心抗原抗体（Anti-HCV Core protein）应用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），制备抗丙型肝炎病毒核心抗原酶标抗体，根据酶联免疫操作步骤，应用美国Ortho公司试剂盒的其它组分，建立一种丙型肝炎病毒核心抗原双抗夹心检测法，并对比市场上的试剂盒进行检测。

标签：丙型肝炎病毒核心抗原；辣根过氧化物酶；标记；临床0 引言丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播。

本实验通过用辣根过氧化物酶（HRP），对抗丙肝核心抗原抗体进行标记，利用美国ortho公司成品试剂盒的其他组分，组装形成丙型肝炎核心抗原检测试剂盒，验证自制试剂盒的准确性、特异性以及与ortho公司产品的相关性。

1 材料和方法1.1 材料（1）实验试剂。

辣根过氧化物酶（sigma）；过碘酸钠（百灵威科技有限公司）；抗HCV-cAg单克隆抗体（美国赛莱克斯cellex公司）；丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（美国0rtho公司）；0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液；0.01mol/L，pH7.4 磷酸盐缓冲液；1.0mol/L，pH9.5 碳酸盐缓冲液。

（2）主要仪器。

BIOBASE8001全自动酶免工作站，山东博科生物产业有限公司；BIOBASE洗板机，山东博科生物产业有限公司；DHP-260恒温培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司；微孔板恒温振荡器，上海岛韩实业有限公司；高速冷冻离心机，中科中佳HC-3018R。

1.2 实验方法（1）试剂盒的应用及检测实际操作。

（2）样品排布。

利用自产的试剂盒与美国ortho公司的对照，检测临床42个样本，对阴阳性符合率进行验证。

每个样本先用ortho公司的检测。

（3）试剂盒的特异性。

选取临床上的病理样本，分别为27例类风湿因子（RF）阳性样本，25例免疫球蛋白阳性样本，18例自身抗体阳性样本（上述样本抗HCV和HCV均为阴性），用自配制的酶标抗体和ortho 公司的酶标抗体各检测一次，验证试剂盒的特异性。

专利名称：人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：庄明强
申请号：CN201310078878.2
申请日：20130312
公开号：CN103214561A
公开日：
20130724
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种人丙型肝炎病毒核心抗原，利用这种抗原蛋白可应用于免疫产生针对丙型肝炎核心抗原的单克隆抗体。

本发明采用基因工程方法研制重组融合蛋白可溶性抗原，特点是抗原具有相对完整的天然蛋白空间结构，在用于免疫产生抗核心抗原抗体上，具有较线性的合成肽抗原，抗体特异性高，对天然样品中的核心抗原特异性和亲和性更佳的特点。

申请人：浙江家和制药有限公司
地址：314204 浙江省嘉兴市平湖市穗轮工业园区
国籍：CN
代理机构：杭州华鼎知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：魏亮
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丙型肝炎病毒的抗体检测技术及应用丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（HCV）引起的肝炎疾病，全球范围内仍然是一个重要的公共卫生问题。

据世界卫生组织数据，全球约有7100万人感染了丙型肝炎病毒，其中大约399万人患有慢性肝炎，严重威胁着人们的健康。

因此，丙型肝炎病毒的抗体检测技术及其应用显得尤为重要。

一、丙型肝炎病毒抗体检测技术的发展随着科技的不断进步，丙型肝炎病毒抗体检测技术也得到了长足的发展。

最早的检测方法是采用酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法能够检测人体血液中是否存在丙型肝炎病毒抗体。

然而，由于ELISA方法的特异性和敏感性有限，存在一定的假阳性和假阴性结果。

为了提高检测的准确性，研究人员不断改进和创新，推出了更加高级的技术。

其中，核酸检测技术（如聚合酶链反应，PCR）的出现，使得丙型肝炎病毒的早期诊断成为可能。

此外，流式细胞术、免疫荧光技术、免疫印迹等技术也被广泛应用于丙型肝炎病毒抗体检测中，大大提高了检测的准确性和灵敏度。

二、丙型肝炎病毒抗体检测技术的应用1. 临床诊断丙型肝炎病毒抗体检测技术在临床诊断中起着至关重要的作用。

通过检测患者的血清样本，可以确定是否感染了丙型肝炎病毒。

对于患者来说，早期的诊断可以帮助医生及时采取相应的治疗措施，减少肝脏损伤，提高治愈率。

2. 疫情监测丙型肝炎病毒抗体检测技术也广泛应用于疫情监测中。

通过对不同人群进行抗体检测，可以了解感染率的高低，及时采取措施进行防控。

尤其是在高感染风险的人群中，如输血史、注射毒品者等，定期进行抗体检测可以有效预防疫情的扩散。

3. 疫苗研发丙型肝炎病毒抗体检测技术对于疫苗研发也起到了重要的推动作用。

在疫苗研制过程中，需要进行大规模的临床试验，通过抗体检测技术可以评估疫苗的免疫效果和安全性，为疫苗的上市提供科学依据。

三、技术发展和挑战丙型肝炎病毒抗体检测技术在不断发展的同时，也面临一些技术挑战。

首先，由于丙型肝炎病毒的高变异性，不同基因型之间的差异较大，检测方法需要具备足够的特异性。

丙型肝炎核心抗原检测试剂的临床应用中国病毒病杂志２０１３年１月第３卷第１期陈新月1，窦晓光2，Dale Hu3，高峰4，高省5，华文浩6，贾继东7，蒋岩8，John Klena3，鲁凤民9，卢胜男10，欧启水11，魏来12，汪宁8，徐英春13，殷鹏14，张继明15，赵秀英16，庄辉9丙型肝炎核心抗原检测是新近发展的一种HCV感染的检测方法。

由于感染HCV 后，HCV核心抗原出现较早，且与血清中HCV RNA载量呈正相关，并在HCV感染治愈或康复后消失，因此，可作为HCV感染的早期诊断、献血员筛查、慢性HCV感染诊断、高危人群监测、免疫功能障碍患者的HCV感染诊断、鉴别既往感染抑或现症感染，并可用于抗病毒疗效的预测和监测。

1．HCV感染的早期诊断人感染HCV到产生抗-HCV的平均时间约60d，被称为抗-HCV的窗口期。

但HCV 核心抗原于HCV感染后12～15d即可检测到，较抗-HCV出现提前5～7周。

Peterson等报告，HCV核心抗原的出现时间仅较HCV RNA晚1d。

因此，HCV核心抗原筛查可作为HCV感染的早期诊断。

2．用于献血员筛查Lee等检测血液中心128例HCV窗口期感染的血液标本（抗-HCV阴性，HCV RNA 阳性），结果HCV核心抗原的检出率为94%。

Brojer等检测波兰14.4万例血液中心的血标本，2例HCV核心抗原阳性。

因此，波兰考虑将HCV核心抗原作为常规献血员筛查项目之一。

目前，克罗地亚已将HCV核心抗原作为献血员筛查项目之一。

3 ．抗-HCV补充试验我国《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（试行）》指出：对初筛呈阳性反应的样品，应用原有试剂双孔或原有试剂加另一种不同原理（或厂家）试剂进行复检，如呈一阴一阳反应者，应进行补充试验。

目前常用的补充试验系用RIBA，如Chiron RIBA HCV 3.0 SIA抗HCV确证试剂（RIBA）和新加坡MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd公司生产的丙型肝炎病毒抗体补充试剂盒（蛋白印迹法）（HCVBlot 3.0，简称MP），但该法价格较贵，操作较复杂，一般实验室不开展此试验。