单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的研制_张丹丹

关键词 单核细胞增生李斯特菌； 荧光定量 PCR； 检测试剂盒 文章编号 1009-7848（2011）03-0138-06
单核细胞增生李斯特 菌 （Listeria monocytogenes）， 简 称 “ 单 增 李 斯 特 菌 ”， 是 一 种 重 要 的 食 源 性致病菌，在自然界分布广泛。 蔬菜、乳制品、海产 品、 肉类和禽类等食品都已被证实是单增李斯特 菌的传播载体[1]。 该菌的易感人群主要是孕妇、新 生儿、老年人和免疫缺陷者[2]，感 染 人 体 后 可 引 起 李斯特菌病，其症状表现为脑膜炎、败血症和流产 等，致死率高达 20%～50%[3-4]。 因此，单增李斯特菌 是 世 界 卫 生 组 织 （WHO）食 品 安 全 工 作 计 划 中 重 点检测的四大食源性致病菌之一[5]。
第 11 卷 第 3 期 2011 年6月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol． 11 No． 3 Jun． 2 0 1 1
单核细胞增生李斯特菌荧光定量 PCR 检测试剂盒的研制
张丹丹 龙 飞 王大鹏 施春雷 史贤明 * （上海交通大学农业与生物学院陆伯勋食品安全研究中心 中美食品安全联合研究中心 上海 200240）
ΔRn CT
1、10、20、30 和 40 次后分别对同一单增李斯特菌 标准菌株基因组 DNA 进行 PCR 扩增。 采用 SPSS 16.0 软件对数据进行统计分析。 1.8.5 保存期 将本试验中建立的单增李斯特菌 荧光定量 PCR 试剂盒置于-20 ℃冷冻保存， 定期 取出检测，确定其保存期。
摘要 目的：建立一种用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的荧光定量 PCR 试剂盒。 方法：根据本课题组前期 工作基 础 ，针 对 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 hly 基 因 序 列 设 计 TaqMan 探 针 和 引 物 ，建 立 荧 光 定 量 PCR 检 测 方 法 ， 将反应试剂组装成试剂盒，并对该试剂盒的各项参数进行评价。 结果：特异性试验表明，组装的试剂盒对 8 株单 核细胞增生李斯特菌标准菌株的检测均呈阳性反应，对 6 株其它种的李斯特菌及 13 株食品（环境）中常见的非 李斯特污染菌（如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）呈阴性反应。 该试剂盒的基因组 DNA 检测灵敏度为 3.94 fg/反应 （约合 1.34 CFU/反应）。 该试剂盒批内平均变异系数为 2.2%，批间变异系数为 1.9%，具有良好的重复性；同时稳 定性强，反复冻融处理对其无明显影响；可在-20 ℃下避光保存 1 年。 结论：该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、 重复性好、稳定性强等优点，可应用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。
ATCC 49452
1
肺炎链球菌 （Streptococcus pneumoniae）
ATCC 27336
1
大肠杆菌 O157：H7 （Escherichia coli O157：H7）
ATCC 43889
1
枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）
ATCC 6633
1
弗氏柠檬酸杆菌 （Citrobacter freundii）
复性，而且避免了常规 PCR 易引起放射性物质污 染 和 使 用 致 癌 性 染 色 剂 等 缺 点 [10-11]， 已 越 来 越 多 地 应用于人类和动植物传染病的诊断中。 在本课题 组 已 有 的 研 究 基 础 上[12]，本 文 研 制 单 增 李 斯 特 菌 实时荧光定量 PCR 检测试剂盒，旨在为单增李斯 特菌的检测提供一种更加快速、简便、灵敏和特异 的检测手段。
5′-CATGGCACCACCAGCATC-3′
hlyPR
5′-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3′
探针
hly-probe
5′-FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA–ECLIPCE-3′
注：a.此段序列位于单核细胞增生李斯特菌株 EGD 全基因组序列中（序列号：AL591824）。
位置 （bp）a
205932-205949 205977-205996
205951-205974
140
中国食品学报
2011 年第 3 期
1.4 标准阳性模板的制备 标准阳性模板 pM-Lm 由本课题组工作人员
将扩增产物克隆到 pMD18-T 载体上制备而成，并 经 PCR 和序列分析验证。 1.5 菌株 DNA 模板的制备
将李斯特菌属菌株和非李斯特菌属菌株分别 接 种 于 脑 心 浸 出 液 肉 汤 （BHI）培 养 基 上 ，37 ℃过 夜培养后，按照 AllMagTM 全血基因组 DNA 纯化试 剂盒的操作说明制备模板。 1.6 荧光定量 PCR 反应体系及扩增反应条件
荧光 PCR 反应采用 20 μL 体系，反应液中含 10 ×PCR buffer 2 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.5 μL， dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL，上 、下 游 引 物 （5 μmol/ L）各 1 μL，热 启 动 Taq DNA 酶 （5 U/μL）0.2 μL， 探针（5 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板 2 μL，最后补充 灭菌去离子水至 20 μL。 荧光定量 PCR 循环参数 为：第一阶段：95 ℃预变性 15 s；第二阶段：95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，进行 45 个循环。 1.7 标准曲线的建立
35 30 25 20 15
20 30 100 200 1000
Y=-3.914x+41.718 r2=0.999
10000 100000 定量值
1000000 10000000
图 1 实时荧光定量 PCR 检测标准阳性模板的标准曲线 Fig.1 Standard curve for positive control by FQ-PCR
2 结果与分析
2.1 标准曲线的建立 根据标准阳性模板建立标准曲线 （图 1），线
性 回 归 方 程 y =-3.914x +41.718， 相 关 系 数 r2 = 0.999。 起 始 模 板 在 107～101 拷 贝/μL 范 围 线 性 良 好，其线性范围可达到 7 个数量级（107～101）。
英诺克李斯特菌（L. innocua ）
CCTCC AB97022
1
绵羊李斯特菌（L. ivanovii）
CCTCC AB97016
1
格氏李斯特菌（L. murrayi）
CCTCC ABBiblioteka 70171西尔李斯特菌 （L. seeligeri）
CCTCC AB97018
1
格氏李斯特菌（L. grayi ）
ATCC 8090
1
沙雷氏菌 （Serratia liquefaciens）
ATCC 27592
1
PCR 结果 + + + + + + + + -
1.2 试剂盒组成 试剂盒中包含荧光定量 PCR 反应液 （含 10×
PCR buffer、引 物 、MgCl2、dNTPs）、荧 光 探 针 、热 启 动 TaqDNA 酶、标准阳性模板和阴性质控标准品。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 主 要 试 剂 和 仪 器 热 启 动 Taq DNA 酶 、 dNTPs、 引 物 和 荧 光 探 针 ， 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司；DNA 抽提试剂盒 （AllMagTM 全血基因组 DNA 纯化试剂盒）， 上海奥润微纳新材料科技有限公 司 ；荧 光 定 量 PCR 仪 （ABI7500），ABI 公 司 ； 紫 外 核酸与蛋白质分析仪，Beckman Coulter DU800。 1.1.2 菌株 如表 1 所示， 选择 8 株单增李斯特 菌标准菌株及 19 株非单增李斯特菌作为实验菌 株， 其中单增李斯特菌标准菌株购于广东省微生 物研究所微生物菌种保藏中心和中国典型培养物 保藏中心（CCTCC），或上 海 出 入 境 检 验 检 疫 局 馈 赠。 其余菌株由上海交通大学中美食品安全联合 研究中心的食品安全与微生物研究室保藏。
1
单核细胞增生李斯特菌
ATCC 13313
1
单核细胞增生李斯特菌
ATCC 13932
1
单核细胞增生李斯特菌
ATCC 7644
1
单核细胞增生李斯特菌
ATCC 27708
1
单核细胞增生李斯特菌
CMCC 54002
1
单核细胞增生李斯特菌
CMCC 54003
1
单核细胞增生李斯特菌
CCTCC AB97021
1
收稿日期： 2010-06-10 基金项目： “十一五” 国家科技支撑计划项目（2009BADB
9B01）； 科技部国际合作项 目 （2011DFA31220， 2009DFA31770）； 上海市科学仪器及化学试剂 项 目 （10142201300，09142201200） 作者简介： 张丹丹，女，1986 年出生，硕士 通讯作者： 史贤明
ATCC 12453
1
痢疾志贺菌 （Shigella dysenteriae）
CMCC 51335
1
藤黄八叠球菌 （Sarcina lutea）
ATCC 9341
1
阴沟肠杆菌 （Enterobacter cloacae）
ATCC 700323
1
粪肠球菌 （Enterococcus faecalis）
将标准阳性模板 10 倍系列稀释为 109～101 拷 贝/μL 的浓度梯度， 采用已建立的荧光定量 PCR 体系进行扩增，每个浓度作 3 个重复，反应结束后 采用 ABI 7500 v2.0.1 软件分析。 1.8 试剂盒检测参数的评价 1.8.1 特异性 提 取 本 文 1.1.2 节 所 列 菌 株 的 基 因 组 DNA 后 ，取 2 μL 作 为 模 板 ，用 本 试 验 中 建 立的荧光定量 PCR 试剂盒进行扩增。 1.8.2 灵 敏 度 提 取 单 增 李 斯 特 菌 标 准 菌 株 ATCC BAA-751 的基因组 DNA， 并测定其浓度， 做 10 倍系列梯度稀释， 每个稀释度各取 2 μL 作 为模 板 ，用 荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒 进 行 扩 增 ，计 算 其灵敏度。 1.8.3 重复性 采用本试验中建立的试剂 盒 ，对 2 株单增李斯特菌参考菌株分别进行 6 孔重复检 测试验，比较 Ct 值，并计算 Ct 值变异系数（组内变 异系数，inter-assay CV%）；同时，对 1 株单增李斯 特 菌 参 考 菌 株 进 行 6 次 独 立 检 测 试 验 ， 比 较 Ct 值， 并计算 Ct 值变异系数 （组间变异系数，intraassay CV%）。 1.8.4 稳定性 将试剂盒从-20 ℃取出，室温下使 其中试剂融化为液体，再置-20 ℃冷冻，如此冻融