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单增李斯特菌PFGE分型实验室标准操作程序生物安全警示：目前李斯特菌感染剂量尚不确定，取决于宿主的易感性。
高风险感染群体为孕妇、婴儿、免疫力低下病人和老人。
所以，接触李斯特菌的实验人员必须意识到潜在的风险并且注意相关的建议。
Day 0受试培养物单菌落划线于脑心浸液平板，于37℃培养14-18 h。
建议利用螺口管保存菌种一支，并且用同一接种环划线平板。
确保需要时可以对同一培养物进行试验。
Day 11.开启水浴摇床（54-55℃）、水浴箱（55-60℃）和分光光度计。
2.准备TE buffer（10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0），配方如下：10 ml 1 M Tris，pH 8.0，2 mL 0.5 M EDTA，pH 8.0，稀释于1000 mL无菌超纯水（临床实验室试剂用水）。
注意：TE buffer用于SeaKem 琼脂糖胶栓制备、悬浮细胞和洗涤裂解的PFGE胶栓。
3.准备溶菌酶（sigma L7651）母液（20 mg/mL），配方如下：a.称量100 mg溶菌酶（器皿放置于冰上保持低温）b.加入5 mL TE buffer，涡旋混合。
c.分装（250 μL）于eppendorf管中，冷冻备用。
4.TE buffer (10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0)制备1% SeaKem 金琼脂糖+1%SDS，配方如下：a.20% SDS储液置于55-60℃水浴箱预热；b.称取0.25 g SeaKem 金琼脂糖，加入25 ml TE buffer，温和混匀，微波加热至完全溶解；c.加入2.5 ml 10% SDS，混匀，置于55-60℃水浴箱中备用。
5.将培养物编号标记于Falcon2054管，吸取2 mL TE buffer于管中，用灭菌棉签或接种环刮去培养物，轻轻转动接种环（棉签）将培养物悬浮于TE buffer 中，尽量避免产生气泡。
注意：细胞悬浮液体积大小取决于细胞浊度测定仪的使用体积。
单核细胞增生李斯特氏菌测定1 提示1.1 注意无菌操作。
2目的用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的测定3检测依据《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌测定（GB 4789.30-2016）》。
4适用范围本法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的测定。
5试验材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1冰箱。
5.2 恒温培养箱。
5.3 均质器。
5.4 显微镜。
5.5 电子天平。
5.6 锥形瓶。
5.7 无菌吸管、微量移液器及吸头。
5.8 无菌平皿。
5.9 无菌试管。
5.10 离心管。
5.11 无菌注射器。
5.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。
5.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。
5.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。
5.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。
5.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金5.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。
5.18 小白鼠:ICR体重18g～22g。
5.19 全自动微生物生化鉴定系统。
6.培养基和试剂6.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):。
6.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):。
6.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):。
6.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:。
6.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:。
乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验YLNB 4.6 1. 仪器及器材1.1 恒温培养箱：30±1℃、24±1℃1.2 恒温水浴锅：46±1℃。
1.3 显微镜：10×～100×1.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。
1.6 灭菌平皿：直径90mm。
1.7 灭菌试管： 16mm×160mm1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL 刻度）。
1.9 冰箱：0－4℃1.10 锥形瓶：100mL、500mL。
1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。
1.12 离心管：30mm×300mm。
1.13 灭菌注射器：11.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
1.15 马红球菌。
1.16 小白鼠：16g～18g。
2. 培养基和试剂2.1含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。
2.2含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。
2.3 EB增菌液：见附录A3。
2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。
2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。
2.6 SIM动力培养基：见附录A5。
2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。
2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。
2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中3.17。
2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/T4789.28中3.4。
2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中3.2。
2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。
2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。
2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。
3. 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：检样25g(ml)EB增菌液225ml LB1增菌液225ml30℃,48h 30℃,24h30℃,24h30℃,24～48h25℃ 2d ～5d(伞状)30℃,24h30℃,24hLB2增菌液225ml选择性培养基(MMA)SIM 动力培养基 TSI 琼脂TSA-YE 培养基显微镜下观察运动硝酸盐还原实验 过氧化氢酶实验 甘露醇 木醇 鼠李糖 七叶苷 溶血实验协同溶血实验 小鼠致病力实验 革兰氏染色 MR-VP 实验4. 方法4.1 样品的收集及处理无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。
DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。
1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。
1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。
2.4 显微镜:10×～100×.2。
5 电子天平:感量0。
1 g。
2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。
2。
7 无菌吸管:1 mL（具0。
01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿:直径90 mm。
2。
9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2。
10 离心管:30 mm×100 mm.2。
11 无菌注射器:1 mL。
2。
12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2。
14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3。
1 含0。
6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。
1.3。
2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
单核细胞增生李斯特氏菌及检验单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。
一、生物学特性1、形态与染色该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在养分丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培育中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。
2、培育特性该菌养分要求不高，在20--25℃培育有动力，穿刺培育25天可见倒立伞状生长，肉汤培育物在显微镜下可见翻跟斗运动。
该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培育温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。
在固体培育基上，菌落初始很小，透亮，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透亮。
在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培育后可产生窄小的β-溶血环。
在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照耀菌落，通过解剖镜垂直观看，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
3、生化反应该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
李斯特实验流程
李斯特实验主要包括以下几个步骤：
1. 增菌培养：取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无
选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h
和44h。
2. 样本处理：可能包括离心、过滤等步骤，以获取纯净的李斯特菌样本。
确保处理过程在无菌条件下进行。
3. 显色培养基涂布：使用无菌的移液器或吸管，在李斯特菌显色培养基表面均匀涂布样本。
确保样本均匀分布在培养基上。
4. 培养条件：将培养基培养皿放入恒温培养箱，通常在35-37摄氏度下培养。
设定观察时间点，通常在培养开始后的24小时和48小时后。
5. 观察：在设定的时间点观察实验结果，如果发现有李斯特菌存在，可以进行进一步的鉴定和计数。
请注意，以上步骤仅为一般流程，具体操作可能因实验需求和样品类型而有所不同。
进行实验时，请遵循相关安全规定和操作规范，以确保实验结果准确可靠。
MM_FS_CNJ_03出口食品单核细胞增生李斯特氏菌斜射光镜MM_FS_CNJ_0344 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法1. 适用范围本方法适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。
其他食品可参照采用。
2. 原理概要单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。
在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TS2 YE、选择性培养基（MMA等平板上用45°角斜射光照射可观察到蓝色菌落；水解七叶苷并与柠檬酸铁铵反应产生黑色菌落。
3. 主要试剂和仪器. 主要试剂（包括培养基）胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE （见B1）；胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA- YE （见B2）; 增菌培养液（EB （见B3 ；选择性培养基（MMA （见B4 ；牛津琼脂（见B5 ；改良缓冲蛋白胨水（MBP （见B6 ；7％羊血琼脂（见B7 ；糖发酵培养基（见B8 ；半固体琼脂；尿素琼脂；硝酸盐培养基；MR- VP培养基；三糖铁琼脂（TSI 。
胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨；盐酸吖啶黄素；萘啶酮酸；复达新；甘氨酸酐；氯化锂；苯乙醇；放线菌酮；多粘菌素E；头孢双硫唑甲氧；磷霉素；柠檬酸铁铵；七叶苷；酚红；D—葡萄糖；D—甘露醇；哥伦比亚琼脂；酵母浸膏；牛肉浸膏。
. 仪器微生物学实验室常用设备；解剖镜；斜射灯；平面镜。
4. 过程简述. 样品如为冷冻食品，应于2〜5C解冻，且不超过18h,若不能及时检验，应置于 -15C保存。
非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4C 冰箱保存，在24h 之内检验。
. 前增菌和增菌前增菌：巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。
无菌操作称取25g样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP的均质杯内，高速均质1〜2min，制成1 : 10样品匀液，转入500ml T口瓶内；液体食品可用吸管吸取25mL样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水（MBP的广口内，充分振摇制成1 : 10样品匀液，于30C培养24、48h。
水产食品公司实验室出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法1．仪器和设备1．1恒温培养箱：36±1℃1．2恒温水浴箱：45±1℃1．3高压灭菌锅1．4均质器1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm1．7锥形瓶:500ml 250ml1．8平皿：直径为90mm1．9灭菌吸管1．10灭菌均质杯1．11酒精棉1．12天平:感量0.1g2．培养基的制备2．1含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）称取3.6g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，冷却后0～4℃冰箱保存备用。
2.2含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）称取4.7g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却50℃左右倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.3 Fraser肉汤增菌液（FB1、FB2）FB1：称取12.38g药品溶入225ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入FB1添加剂1和添加剂2各1支备用。
FB2：称取1.1g药品溶入20ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入FB2添加剂1和添加剂2各1支备用。
2.4 PALCAM琼脂称取6.61g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入PALCAM添加剂1和添加剂2各0.4ml，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.5 OXA琼脂称取5.85g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入吖啶黄素、放线菌酮、多粘菌素E各1支，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.6 7％羊血琼脂2.7 SIM动力培养基称取3.0g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成高层斜面，冷却后0～4℃冰箱保存备用。
一、编制目的为规范本单位单核细胞增李斯特氏菌的检验方法，编制本指导书。
二、适用范围本指导书规定了食品单核细胞增李斯特氏菌的检验方法。
第一法适用于食品中单核细胞增李斯特氏菌的定性检验；第二法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数；第三法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较低（<100CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数，特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。
三、编制依据GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。
四、设备和材料4.1冰箱:2℃一5℃。
4.2恒温培养箱:30℃±1℃ , 36℃士1℃。
4.3均质器。
4.4显微镜:lOX一100X。
4.5电了天平:感量0.1 g。
4.6锥形瓶:100mL、500mL。
4.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
4.8无菌平皿:直径90mm。
4.9无菌试管:16mm×160mm。
4.10离心管:30mm×100mm。
4.11无菌注射器:1mL。
4.12金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。
4.13马红球菌(Rhodococcus equi)。
4.14小白鼠:16g-18g。
4.15全自动微生物生化鉴定系统。
五、培养基和试剂5.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)。
5.2含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂(TSA-YE)。
5.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2)。
5.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl)溶液。
5.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid)溶液。
5.6 PALCAM琼脂。
5.7革兰氏染液。
5.8 SIM动力培养基。
5.9缓冲葡萄糖蛋白陈水（甲基红(MR)和V-P试验用）。
5.10 5%-8%羊血琼脂。
5.11糖发酵管。
5.12过氧化氢试剂。
ICSSN 备案号：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布前 言SN/T XXXX－XXXX《食品中多种致病菌快速检测－PCR方法》分为十一个部分：─ 第 1 部分：食品中沙门氏菌检测方法；─ 第 2 部分：食品中志贺氏菌检测方法；─ 第 3 部分：食品中金黄色葡萄球菌检测方法；─ 第 4 部分：食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法；─ 第 5 部分：食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法；─ 第 6 部分：食品中空肠弯曲菌检测方法；─ 第 7 部分：食品中肠出血性大肠埃希氏菌 O157:H7检测方法；─ 第 8 部分：食品中副溶血性弧菌检测方法；─ 第 9 部分：食品中霍乱弧菌检测方法；─ 第 10 部分：食品中创伤弧菌检测方法；─ 第 11 部分：食品中阪崎肠杆菌BAX全自动PCR检测方法。
本单核细胞增生李斯特氏菌PCR检测方法分为第一法（普通PCR方法）和第二法BAX®全自动致病菌PCR 检测系统1），第二法修改采用了AOAC International Official Method Listeria monocytogenes2003.12。
本标准的附录A和B是资料性附录。
本标准由国家认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。
本标准起草人：卢行安等。
本标准系首次发布的检验检疫行业标准。
1） 为美国杜邦公司（DuPont Qualicon）的产品。
食品中多种致病菌快速检测－PCR方法第5部分：食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法1 范围本部分规定了用普通PCR技术快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。
本部分适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
DBS22 DBS22/019-2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写。
本标准分为两种检测方法：第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。
其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。
本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。
本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。
本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：2℃～5℃和-18℃。
2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 显微镜：10×～100×。
2.5 电子天平：感量0.1 g。
2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。
2.8 无菌平皿：直径90 mm。
2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。
2.10 离心管：30 mm×100 mm。
2.11 无菌注射器：1 mL。
2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。
2.14 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。
3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。
3.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。
3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1。
3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。
3.7 革兰氏染液：见附录A中A.5。
3.8 SIM动力培养基：见附录A中A.6。
3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。
3.10 5%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。
3.11 糖发酵管：见附录A中A.9。
3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。
3.13 李斯特氏菌显色培养基。
3.14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒。
第一法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图1。
图1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序5 操作步骤5.1 样品处理冷冻样品应在45℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24 h内检验。
5.2 样品制备称取样品25g，放入盛有225mL PBS或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。
若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。
5.3 样品的稀释吸取上述1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。
据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
5.4 样品接种根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块李斯特显色或PALCAM琼脂培养基，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。
使用前，如李斯特显色或PALCAM琼脂培养基表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
5.5 分离、培养在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。
如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养24 h±2 h。
如果菌落不典型,可继续培养至48 h±2 h再观察。
在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上，典型菌落为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈（其它品牌李斯特氏菌显培养基上的菌落特征按照产品说明书判定）。
典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
6 确证实验6.1 初筛自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于36℃±1℃培养24 h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24 h～48 h。
选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
6.2鉴定6.2.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
6.2.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。
6.2.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。
单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
6.2.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24 h～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。
6.2.5协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24 h～48 h。
单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。
6.2.6 可选择API listeria 10300生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。
7 结果计算7.1 典型菌落计数和确认7.1.1 选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。
如果：a）只有一个稀释度的平板菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）所有稀释度的平板菌落数均小于20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU～200 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU 或大于200CFU 时，应计数最接近20 CFU 或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。
以上按公式（1）计算。
f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU 之间，按公式（2）计算7.1.2从典型菌落中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24 h±2 h。
7.2 结果计数公式（1）：T =CdAB…………………………………………………………… （1） 式中：T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；A ——某一稀释度单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数；B ——鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；C ——用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； d ——稀释因子。
公式（2）： (2)式中：T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； A2——第二稀释度（高稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； 1.1——计算系数（如果第二稀释度单核细胞增生李斯特氏菌鉴定结果为0，计算系数采用1）； d ——稀释因子（第一稀释度）。
8 结果与报告8.1 根据李斯特氏菌显色培养基或PALCAM 琼脂平板上单核细胞增生李斯特氏菌的典型菌落数，按7中公式计算，报告每g （mL ）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g(mL)表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
第二法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法9 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序见图2图2 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序.1d1222111C B A C B A T +=9.1 基于“三管”MPN法，取检样25 g（mL）加入装有225 mL LB1增菌液中，均质制成1:10稀释液，用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL LB1增菌液的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。
9.2 另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管。
9.3 根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度（液体样品可选择原液），每个稀释度接种3支含有9 mL LB1增菌液的试管，每管接种1 mL（如果接种量超过1 mL，则用双料LB1增菌液）。
