[生活]鱼类肌肉蛋白的提取

鱼类肌肉蛋白质和氨基酸的代谢和转运研究鱼类是人们日常饮食中十分重要的食品来源，其富含高品质的蛋白质和多种营养成分，是非常有益健康的食品。

作为蛋白质的主要组成部分，氨基酸的代谢和转运对于鱼类的营养质量和生长发育有着至关重要的作用。

本文将从鱼类的肌肉组织、蛋白质和氨基酸的代谢以及运输通路等方面展开研究，以期对其营养学价值和发展前景有更加深入的了解。

鱼类肌肉组织是蛋白质主要的来源，同时也是机体中最重要的蛋白质库。

在鱼类的肌肉组织中，蛋白质主要由肌纤维蛋白和肌球蛋白组成，而且肌纤维蛋白数量比肌球蛋白多。

肌球蛋白是一种高度保守的蛋白质，在不同种类的鱼类中具有相似的氨基酸组成和序列。

而肌纤维蛋白具有更加多样的氨基酸组成和序列，这与其在不同的肌肉类型中的表达有关。

例如，快肌组织中肌纤维蛋白的含量较高，含有更多的XX氨基酸，在肌肉的疲劳和收缩方面发挥重要作用。

相比之下，慢肌组织中肌纤维蛋白的含量较低，其XX氨基酸含量也不同，这与慢肌组织的功能有关，其主要是维持鱼类的基础代谢活动。

鱼类的氨基酸和蛋白质代谢是通过一系列的化学反应进行的。

在这个过程中，氨基酸先经过转氨酶的催化，与α-酮酸形成相应的酰基化物。

这个过程是可逆的，可以根据氨基酸的相对浓度进行调节。

同时，这个过程还涉及到氨基酸的运输和转运。

从细胞角度来看，氨基酸和蛋白质在细胞膜上通过载体蛋白进行运输。

其中，载体蛋白被分为两个基本类型：靶向细胞表面和细胞内的载体蛋白；同时，这些载体蛋白也分为不同的类别，包括氨基酸载体蛋白、肽载体蛋白和蛋白质载体蛋白等。

这些不同类型的载体蛋白根据其在不同组织和细胞中的存在和表达而有所不同。

细胞内的氨基酸运输和代谢也是分为各种不同的通路和途径的。

其中，通过蛋白质降解产生的氨基酸可以进入肝细胞，被转化为尿素通过尿液排出体外。

此外，氨基酸还可以通过进入肝细胞进行氧化代谢，生成甘氨酸，进而转化为葡萄糖和脂肪酸等。

另外，适量的氨基酸也可以直接进入细胞质，作为新的蛋白质合成的前体，或作为能量来源进行利用。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101263859A [43]公开日2008年9月17日[21]申请号200710067703.6[22]申请日2007.03.16[21]申请号200710067703.6[71]申请人浙江海洋学院地址316004浙江省舟山市定海区文化路105号[72]发明人夏松养 [74]专利代理机构舟山固浚专利事务所代理人范荣新[51]Int.CI.A23J 1/04 (2006.01)A23J 1/00 (2006.01)A23J 3/22 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页[54]发明名称水产加工废水中鱼蛋白的提取方法[57]摘要本发明提供的水产加工废水中鱼蛋白的提取方法，先除去漂浮于废水上的脂质，随后对除去鱼肉颗粒的废水进行等电点测定，再调节废水的pH值至等电点使蛋白沉降，然后去除上清液得蛋白液，最后将所得蛋白液用离心方法取得湿蛋白。

本发明提供的水产加工废水中鱼蛋白的提取方法，先将水产加工废水进行等电点测定，再用蛋白等电点分离法使蛋白沉淀，又用离心分离法获得湿蛋白。

即本发明提供的水产加工废水中鱼蛋白的提取方法，可有效地提取出废水水产加工中的鱼蛋白，投入小、操作简单、成本低、提取率高、变废为宝。

200710067703.6权 利 要 求 书第1/1页 1. 一种水产加工废水中鱼蛋白的提取方法，其特征是先除去漂浮于废水上的脂质，随后对除去鱼肉颗粒的废水进行等电点测定，再调节废水的pH值至等电点使蛋白沉降，然后去除上清液得蛋白液，最后将所得蛋白液用离心方法取得湿蛋白。

2. 如权利要求1所述的提取方法，其特征是在除去漂浮于废水上的脂质后，先用过滤的方法将鱼肉颗粒分离出废水。

3. 如权利要求1或2所述的提取方法，其特征是用过滤的方法滤得的鱼肉颗粒在对所得蛋白液离心时加入或直接干燥。

4. 如权利要求2所述的提取方法，其特征是对用过滤的方法滤得的鱼肉颗粒用干燥粉碎的方法得蛋白粉。

鱼蛋白提取技术的概念
鱼蛋白提取技术是一种针对鱼类原料进行蛋白质分离和提取的技术，
其主要目的是在保证鱼类原料营养成分完整的基础上，将其中的蛋白
质分离出来进行加工利用。

鱼蛋白提取技术的主要内容包括以下几个方面：
1. 鱼类原料处理：首先需要对鱼类原料进行预处理，包括去除头、内
脏等不需要的部位，并将肉切成小块或细碎。

此外，还需要对原料进
行清洗和消毒处理，以确保产品的卫生安全。

2. 蛋白质分离：通过物理或化学方法将鱼肉中的蛋白质与其他成分分
离开来。

常用的方法包括溶解、沉淀、过滤、离心等。

3. 蛋白质浓缩：将分离出来的蛋白质进行浓缩，以便后续加工利用。

浓缩方法有多种，如超滤法、逆渗透法等。

4. 蛋白质干燥：经过浓缩后得到的蛋白质液需要进行干燥处理，以便
储存和运输。

干燥方法有喷雾干燥、真空干燥等。

5. 蛋白质加工：将干燥后的蛋白质进行加工，可制成各种食品添加剂、
保健品、营养品等。

鱼蛋白提取技术的应用非常广泛，可以用于生产多种食品和保健品。

例如，鱼蛋白可以用于制作肉制品、面包、饼干等食品添加剂，也可以作为营养补充剂、体育营养品等。

总之，鱼蛋白提取技术是一项非常重要的技术，在食品工业和保健品行业有着广泛的应用前景。

随着人们对营养健康需求的不断增加，相信这项技术将会得到更加广泛的应用和发展。

鱼胶原蛋白肽的提取方法鱼胶原蛋白的提取方法主要有：水解胶原蛋白法、酶解法等，现在比较流行的是酶解法。

就胶原蛋白本身来说，胶原蛋白具有一种比DNA分子的“双螺旋”结构更为神奇的“三螺旋”结构。

蛋白质结构与功能的统一性，功能对结构的依赖性，要求胶原蛋白肽的提取方法非常严格，技术要求较高。

酶解法提取深海鳕鱼胶原蛋白肽的生产工序和生产过程主要包括：清洗、酶解、过滤、灌装、浓缩、喷雾干燥等几道重要的生产环节，下面分述各个工序所用的设备和生产步骤。

1、清洗：这个工序中所用原料如果从原料供应商处直接购买脱灰鳕鱼的话，可不考虑建设，但是如果是从深海鳕鱼中自行脱灰脱脂处理的话，需有建设地面清洗槽。

清洗槽应设计有一个或几个即可，用来酸、碱脱脂脱灰处理。

此工序要特别注意酸碱度的浓度大小，而且清洗过程中所用的水应为去离子水，需配套双级反渗透纯化水。

2、酶解：脱脂脱灰处理后的鱼鳞投入酶解反应罐中，进行保温酶解。

所用设备和配套设施有双层保温耐压酶解罐、操作平台、燃油蒸汽锅炉。

（注：与物料直接接触的生产设备材质均为304以上不锈钢，物料运送过程中使用卫生软管和不锈钢材质的管道。

）3、过滤：此工序利用立式硅藻土过滤机将酶解液进行精滤，以达到下道工序的使用要求。

所用设备和配套设施有两套单层耐压储液罐造价、立式硅藻土过滤机，车间10万级空调净化设备（公用）。

4、灌装：如果产品需使用液体状，则过滤后的液体可直接分装成标准小桶的包装。

检验合格后入库保存。

需使用单层耐压储液罐，包装桶烘干灭菌室。

5、浓缩、喷雾干燥：过滤后的液体在进喷雾塔前需浓缩达到一定浓度后才可以喷雾干燥，这对提高经济效益和生产效率的意义很大。

此工序所用设备和配套设施有单层耐压储液罐、单效降膜式浓缩、离心式喷雾干燥塔。

鱼胶原蛋白肽的提取方法直接影响到其功效，而胶原蛋白在提取的过程中，为了去除油脂、杂蛋白等非胶原蛋白成分和将胶原纤维适度松散、胶原蛋白适度的降解。

在这些过程中，难免应用一些酸、碱等化学试剂（甚至有的直接用强酸、碱降解），同时在加工的过程中温度等这些对蛋白质有一定破坏、变性作用的环境存在，都将影响天然胶原蛋白的“三螺旋”结构，即产品的品质和功效。

第1篇实验名称：鱼类蛋白提纯实验实验目的：1. 熟悉鱼类蛋白提取的基本原理和方法。

2. 掌握鱼类蛋白粗提、纯化和鉴定等实验技术。

3. 了解蛋白质在不同溶剂中的溶解性差异，以及盐析、透析等纯化方法的原理和应用。

实验原理：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能。

鱼类蛋白提取是研究蛋白质结构和功能的重要步骤。

本实验通过使用不同的提取方法和纯化技术，从鱼类组织中提取蛋白质，并对提取的蛋白质进行鉴定。

实验材料：1. 鱼肉样本2. 丙酮、甲醇、盐酸、硫酸铵、SDS、考马斯亮蓝G-250等试剂3. 离心机、紫外分光光度计、透析袋、凝胶电泳装置等仪器实验步骤：一、样品处理1. 将鱼肉样本切碎，用丙酮或甲醇进行初步提取，去除脂肪和杂质。

2. 将提取液离心，取上清液作为粗提蛋白溶液。

二、粗提蛋白的纯化1. 盐析法：将粗提蛋白溶液用硫酸铵进行盐析，调节pH值至7.0，离心分离蛋白沉淀。

2. 透析法：将蛋白沉淀用透析袋进行透析，去除小分子杂质。

三、蛋白鉴定1. 紫外分光光度法：测定蛋白溶液的紫外吸收光谱，确定蛋白质的浓度。

2. 凝胶电泳法：将蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质的纯度和分子量。

3. 考马斯亮蓝G-250染色法：观察电泳后的蛋白质条带，判断蛋白质的纯度。

实验结果：一、粗提蛋白的盐析通过硫酸铵盐析，得到白色蛋白沉淀，表明蛋白质成功从鱼肉组织中提取。

二、粗提蛋白的透析通过透析，去除小分子杂质，得到较纯的蛋白溶液。

三、蛋白鉴定1. 紫外分光光度法：蛋白溶液在280nm处有较强的吸收峰，表明存在蛋白质。

2. 凝胶电泳法：电泳结果显示，蛋白溶液在特定位置出现单一条带，表明蛋白质纯度较高。

3. 考马斯亮蓝G-250染色法：电泳后的蛋白质条带颜色均匀，表明蛋白质纯度较高。

实验结论：本实验成功从鱼肉组织中提取了蛋白质，并通过盐析、透析等纯化方法得到了较纯的蛋白溶液。

实验结果表明，紫外分光光度法、凝胶电泳法和考马斯亮蓝G-250染色法均可用于蛋白质的鉴定。

鱼精蛋白生产工艺
鱼精蛋白是一种由鱼类鳞片或鱼肉经过一系列工艺加工而成的高蛋白食品。

下面是鱼精蛋白的生产工艺：
1. 原料选择：选择新鲜的鱼类作为原料，通常选择鱼类中蛋白含量较高的部位，如鱼鳞或鱼肉。

2. 清洗处理：将原料鱼类进行清洗，去除表面的污物和杂质，并剔除鱼鳞或鱼肉中的骨刺。

3. 制浆打浆：将清洗后的鱼类进行制浆打浆，将鱼类打碎，使其成为鱼浆。

这一步骤可以通过机械方法或手工方法完成。

4. 蛋白提取：用适当的酶或酸性溶液将鱼浆中的蛋白质进行提取。

这一步骤可以通过浸泡、搅拌、沉淀等方法来完成。

5. 澄清过滤：将蛋白质提取液进行澄清过滤，去除其中的杂质和固体颗粒。

可以使用滤纸、滤网等过滤器进行过滤。

6. 浓缩干燥：将澄清过滤后的蛋白质溶液进行浓缩干燥，将水分蒸发掉，得到浓缩的鱼精蛋白。

通常可以使用真空浓缩器或喷雾干燥器进行干燥。

7. 粉碎包装：将干燥后的鱼精蛋白进行粉碎，使其成为细小的颗粒，并进行包装。

通常可以使用粉碎机和包装机来完成。

以上就是鱼精蛋白的一般生产工艺。

值得注意的是，在实际生
产过程中，可能还会有其他步骤和工艺进行优化和改进，以提高产品的品质和生产效率。

同时，生产过程中的环境卫生和产品质量安全也是非常重要的因素，需要严格控制和管理。

鱼精蛋白的多种用途鱼精蛋白（Fish Protein Hydrolysate，FPH）是一种从鱼类经过酶解过程提取得到的蛋白质产品。

它具有多种用途，包括农业、食品、医药等领域。

在本文中，我将详细介绍鱼精蛋白的多种用途，并分享一些我对这个产品的观点和理解。

一、农业领域中的应用1. 植物生长促进剂：鱼精蛋白中含有丰富的氨基酸、多肽和微量元素，这些物质对植物的生长和发育具有促进作用。

将鱼精蛋白应用于农作物的生长环境中，可以提高植物的抗病能力、增强养分吸收能力，促进植物的生长和产量的提高。

2. 生物有机肥料：鱼精蛋白中的氨基酸和多肽是植物的重要营养来源，尤其是对于一些特殊或难以寻找的氮源。

将鱼精蛋白作为有机肥料施于土壤中，不仅可以提供植物所需的氮源，还可以改善土壤结构，增加土壤保水性和保肥性，改善土壤生态环境。

3. 鱼精蛋白作为饲料添加剂：由于鱼精蛋白中富含优质蛋白质，以及氨基酸和多肽等营养物质，因此它可以作为饲料中的重要添加剂。

添加适量的鱼精蛋白可以提高饲料的蛋白质含量，增强饲料的营养价值，促进动物的生长发育，提高饲料的利用率，降低养殖成本。

二、食品领域中的应用1. 调味品：鱼精蛋白中的氨基酸和多肽赋予其独特的鲜味和香气。

鱼精蛋白可以作为一种天然的食品调味品，用于增强食物的风味和口感。

在鱼类制品、肉类制品、方便食品、调味料等食品加工过程中，添加适量的鱼精蛋白可以增加食品的鲜美度，提高食欲和口感。

2. 功能性食品：鱼精蛋白中的氨基酸和多肽具有一定的生理活性，可以对人体健康产生积极影响。

将鱼精蛋白应用于功能性食品的研发中，可以开发出具有降血压、改善血脂、增强免疫力等功效的食品产品。

三、医药领域中的应用1. 药物载体：鱼精蛋白具有较好的生物可降解性和生物相容性，可以作为药物的载体用于控释药物。

通过调控鱼精蛋白的结构和性质，可以实现对药物的缓释、靶向输送和保护作用，增加药物的疗效和减轻副作用。

2. 人工血浆：鱼精蛋白具有较好的胶体浓缩性和生理相容性，可以模拟人体血浆，用于临床医学中的输血治疗。

鲤鱼肌肉Ⅴ型胶原蛋白的分离纯化及其抗体制备徐超;鲍俊旺;蔡秋凤;张凌晶;刘光明;曹敏杰【摘要】The type V collagen from common carp muscle was extracted by pepsin digestion and salt pre⁃cipitation . SDS⁃PAGE analysis revealed that the protein contains at least two differentαchains (α1 andα2 ) . The molecular mass ofα1⁃chain was about 135 ku, while that ofα2⁃chain was around 120 ku. The character⁃istic of type V collagen is typical with triple helical structure and its denaturation temperature is 30�5℃ as as⁃sessed by circular dichroism. Purified type V collagen was used as an antigen to immunize a New Zealand rab⁃bit subcutaneously to prepare a specific polyclonal antibody. The specificity of the anti⁃collagen ( V) poly⁃clonal antibody was confirmed by Western blotting and it specifically reactedwith type V collagen from fish.%通过酸溶、胃蛋白酶酶解和氯化钠盐析等方法，从鲤鱼肌肉中纯化得到了 V型胶原蛋白． SDS－PAGE电泳图谱分析发现，其至少由2条α链（α1和α2）组成，其中α1分子质量约为135 ku，α2分子质量约为120 ku．通过圆二色光谱仪分析其二级结构，发现其具有胶原蛋白三股螺旋结构的典型特征，其热变性温度为30�5℃．将V型胶原蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，成功制备了多克隆抗体．采用免疫印迹法对该多克隆抗体的特异性进行分析，证明其仅与鱼类V型胶原蛋白产生反应，特异性良好．【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】6页(P401-406)【关键词】V型胶原蛋白;圆二色谱;多克隆抗体;免疫印迹法;鲤鱼【作者】徐超;鲍俊旺;蔡秋凤;张凌晶;刘光明;曹敏杰【作者单位】集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省水产品深加工工程研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省水产品深加工工程研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省水产品深加工工程研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省水产品深加工工程研究中心，福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q512+.6胶原蛋白(Collagen)是一种高分子蛋白质，是构成细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)非常重要的结构蛋白质之一，在细胞质基质中含量也最为丰富.胶原蛋白广泛存在于动物的皮肤、肌腱、软骨、韧带及其他结缔组织中，具有支撑器官、保护机体的功能，占哺乳动物蛋白质总量的25%~30%[1].生物体内胶原蛋白种类较多，常见的类型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型.在鱼类的肌肉组织中已经报道了Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ等类型的胶原蛋白，其中，Ⅰ型胶原蛋白的含量最为丰富，为主要胶原蛋白，而Ⅴ型胶原蛋白的含量相对较低，为次要胶原蛋白[2].胶原蛋白因为具有良好的生物降解性、生物相容性以及生物活性，如低免疫原性、在体内易被吸收、能促进细胞生长、促进血小板凝结等，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用.胶原蛋白制备的基本原理主要是根据其难于溶解的特性，通过改变蛋白质所在的外界环境，最后实现胶原蛋白与其他蛋白质的分离.鱼类胶原蛋白的提取主要以酸法和酶法为主，也有盐析等提取方法.在实际提取过程中，不同提取方法之间往往互补[3-4].Sato等[5]用酸、酶结合盐析法从鲤鱼(Cyprinus carpio)肌肉中提取出Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白.Wang等[6]从软骨鱼史氏鲟(Acipenser schrenckii)鱼皮中提取了Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白.目前，国内外对于鱼类Ⅰ型胶原蛋白的研究已有很多报道[3-6]，但对于含量较少、提取过程较为复杂的Ⅴ型胶原蛋白的研究报道较少.研究发现，鱼类冷藏过程中肌肉的软化与胶原蛋白(尤其与Ⅴ型胶原蛋白)含量的变化密切相关[2,5].因此，对Ⅴ型胶原蛋白的研究应引起人们的高度关注.本研究从鲤鱼肌肉中分离纯化Ⅴ型胶原蛋白，并成功制备了高特异性多克隆抗体，为今后对鱼类Ⅴ型胶原蛋白的进一步研究提供了新手段.鲜活鲤鱼((1500±200) g)购于厦门集美菜市场，宰杀后取其肌肉立即用于实验.蛋白质分子质量标准购于美国Thermo scientific公司；胃蛋白酶购于国药集团化学试剂有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为 Bio-Rad(美国)公司产品；羊抗兔 IgG-HRP 为DAKO(丹麦)公司产品，ECL 底物为 Pierce(美国)公司产品.其他试剂均为分析纯.组织捣碎机(PT-2100，Kinematica，瑞士)；高速冷冻离心机(Avanti JA-26.5，Beckman，美国)；小型冷冻离心机(Centrifuge 5417，Eppendorf，德国)；超纯水系统(RIOS 8，Millipore，美国)；凝胶成像仪(G-BOX，Syngene，英国)；圆二色光谱仪(Chirascan，Applied Photophysics，英国)；恒温水浴锅(Memmert，德国)；pH计(Sartorius，德国).1.2.1 鲤鱼Ⅴ型胶原蛋白的分离纯化鲤鱼肌肉中胶原蛋白的提取主要参照Sato等[5]和Wang等[6]的方法，并做了适当修改，具体实验步骤如下：将新鲜的鱼肉(1500 g)绞碎后置于10倍体积的0.1 mol/L NaOH溶液中，组织捣碎，离心(5000 r/min，20 min)取沉淀再加入到20倍体积的0.1 mol/L NaOH溶液中，搅拌过夜，此操作重复4次.获得的沉淀用蒸馏水洗至中性，再加入到10倍体积的0.5 mol/L乙酸溶液中，搅拌2 d，离心去除酸不溶性成分.上清液加入质量分数为1%的胃蛋白酶，搅拌2 d，离心去除不溶性成分，上清液再加入NaCl至终浓度为2 mol/L，将胶原蛋白析出，离心(9000r/min，30 min)取沉淀.此时的胶原蛋白主要为Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白的混合物，需要在接下来的步骤通过不同的盐浓度进行分离.得到的沉淀加入50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5,含1 mol/L NaCl)溶解，离心后取上清液，再加入NaCl至终浓度为2.4 mol/L，再进一步离心(24900 r/min，90 min)后所得沉淀即为Ⅰ型胶原蛋白. 在Ⅰ型胶原蛋白的上清液中加入NaCl至终浓度为4.0 mol/L，离心(24900 r/min，90 min)取沉淀，将沉淀复溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，再装入到透析袋中用乙酸溶液透析，期间每4 h换一次透析液.透析24 h加入NaCl至终浓度为0.7 mol/L，离心(10000 r/min，30 min)取上清液，在上清液中加入NaCl至终浓度为2.0 mol/L，离心(10000 r/min，30 min)，沉淀即为V型胶原蛋白.将沉淀复溶并用0.5 mol/L乙酸透析，用于后续实验.1.2.2 圆二色谱对Ⅴ型胶原蛋白的测定将纯化的胶原蛋白质量浓度调整为0.2 g/L，然后放入直径为0.2 cm的比色皿中进行圆二色谱分析.设置波长范围为190~260 nm，步进值为1.0，带宽为1 nm，单点扫描时间为0.5 s，单一温度点为20 ℃.同一个样品重复测量3次.测定胶原蛋白的热变性温度时，从10~80 ℃，每上升1 ℃扫描一次，再将得到的数据经软件分析其热变性温度.1.2.3 Ⅴ型胶原蛋白多克隆抗体的制备取100 μL 1 g/L的纯化V型胶原蛋白与300 μL弗氏完全佐剂混合，置于混合器剧烈振荡使抗原充分乳化，再将乳剂静脉注射至质量约2 kg的新西兰大白兔.两周后，用100 μg V型胶原蛋白与300 μL弗氏不完全佐剂混合，选取不同点加强免疫4次，耳动脉取少量血清检测抗体效价.在效价达到要求后，最后一次采血，将血浆放置于4 ℃静置过夜，然后1500 r/min离心15 min，得到的上清液即为抗血清.将抗血清和0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8.0)等比例混合上样于与预先用相同缓冲液平衡好的Protein A Sepharose预装柱，然后依次用10倍体积的0.1 mol/LTris-HCl(pH=8.0)和0.01 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)开始流洗，直至蛋白质含量A280达基线.用0.1 mol/L甘氨酸(pH=3.0)以1 mL/min的流速进行洗脱，收集样品，用 1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)中和.将纯化得到的IgG多克隆抗体进行分装，于-80 ℃冰箱保存.1.2.4 免疫印迹法(Western blotting)免疫印迹法参考Towbin等[7]的方法，将SDS-PAGE凝胶上的样品转移至硝酸纤维素膜，加入质量分数为5%的脱脂奶室温封闭2 h，TBST漂洗，加入一抗(兔抗V型胶原蛋白抗体，1∶4000)室温孵育2 h，TBST漂洗，再加入HRP 标记的羊抗兔IgG(1∶20000)作为二抗，室温孵育1 h，用TBST漂洗后，加入底物进行化学发光ECL显色.由于不同类型的胶原蛋白在中性和酸性条件下有不同的盐析浓度，根据胶原蛋白这一特性，通过胃蛋白酶酶解和氯化钠盐析从鲤鱼肌肉中分离得到2种不同的胶原蛋白，即：Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白(见图1).鲤鱼V型胶原蛋白α1链(分子质量约135 ku)的含量约为α2链(分子质量约120 ku)的2倍，推测其亚基组成形式可能为α1(V)2α2(V).研究表明，鱼类Ⅴ型胶原蛋白至少由3条α链组成[8-10]，且至少存在4种亚基组成形式，分别是α1(V)2α2(V)、α1(V)α2(V)α3(V)、α2(V)3以及Ⅴ/Ⅵ混合的α链[11].本研究结果与文献[5-6，12-13]提取的Ⅴ型胶原蛋白的电泳图谱结果相似.圆二色光谱(CD)是应用最为广泛的测定生物大分子二级结构的方法，被广泛应用于蛋白质构象研究.如图2所示，鲤鱼Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白的CD光谱波峰在221 nm处，波谷在198 nm处，两条光谱线在210 nm处相交，这是胶原蛋白三股螺旋结构典型的特征[14-15].该结果与Wang等[5]从史氏鲟鱼皮中得到的Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白的圆二色谱扫描结果相似.如图3所示，鲤鱼Ⅴ型胶原蛋白的热变性温度为30.5 ℃.采用同样的方法分析得到鲤鱼Ⅰ型胶原蛋白的热变性温度为28.5 ℃.Wang等[5]从史氏鲟鱼皮中纯化的Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白的热变性温度分别为32.52 ℃和35.92 ℃，说明Ⅴ型比Ⅰ型胶原蛋白热稳定性高，这与本文的研究结果类似.2.3.1 Dot blot法进行抗体效价分析在NC膜上用移液枪点上相同量的抗原，将纯化后的抗V型胶原蛋白多克隆抗体稀释不同倍数作为一抗孵育，经二次抗体反应后进行ECL显色.由图4可知，抗V 型胶原蛋白多克隆抗体的效价可以达到1∶8000.2.3.2 抗Ⅴ型胶原蛋白多克隆抗体的特异性分析采用 Western blotting对抗Ⅴ型胶原蛋白多克隆抗体进行特异性分析.由图5a可知，该抗体仅与鲤鱼Ⅴ型胶原蛋白条带反应，而不与肌肉粗提物中的其他蛋白质反应，表明制备的抗Ⅴ型胶原蛋白多克隆抗体特异性良好.对反应条带进行分析，两条链的反应程度相当，与SDS-PAGE的结果有差异，这可能是由于样品的浓度不同引起的结果.由于Western bloting采用的是ECL法显影，灵敏度高，在样品蛋白浓度较高的情况下，会掩盖这种浓度差异.进一步对该抗体的种属特异性进行分析，从图5b和图5c的结果可知，制备的抗V型胶原蛋白多克隆抗体只与海水鱼蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)肌肉中的V型胶原蛋白有反应，而对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、南美白对虾(Penaeus vannameiBoone)、猪和牛的肌肉粗提液的检测结果均为阴性，表明本研究制备的抗鲤鱼Ⅴ型胶原蛋白多克隆抗体种属特异性良好.本研究通过酸溶、胃蛋白酶酶解和氯化钠盐析等方法从鲤鱼肌肉中纯化得到了Ⅴ型胶原蛋白.在与含量最高的I型胶原蛋白的分离中，利用Ⅰ型和Ⅴ型胶原蛋白在不同的盐浓度下溶解度的差异，采用改变盐浓度的方法把二者分开.SDS-PAGE结果显示，纯化的蛋白质主要由2条α链(α1和α2)组成，其中α1分子质量约为135ku，α2分子质量约为120ku.文献[8-10]报道，鱼类V型胶原蛋白至少由3条α链(主要为α1和α2)组成.最近报道的史氏鲟V型胶原蛋白则由α1、α2和α3组成[6]，这是否是软骨鱼的特征有待进一步验证.本实验得到的V型胶原蛋白α1链的含量约为α2链的2倍，推测α1(V)2α2(Ⅴ)可能为其亚基组成.通过圆二色光谱分析其二级结构，发现V型胶原蛋白具有胶原蛋白三股螺旋结构的典型特征，其热变性温度为30.5 ℃.将纯化的Ⅴ型胶原蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，成功制备了抗V型胶原蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法对制备的多克隆抗体进行特异性分析，发现其特异性良好.采用制备的抗体对其他水产动物和哺乳动物肌肉粗提液进行检测，结果发现，只有蓝圆鲹肌肉中检测到了Ⅴ型胶原蛋白的存在，且只有一条α链有反应，推测这可能是由于不同鱼类之间Ⅴ型胶原蛋白一级结构的差异造成的.利用该抗体，在皱纹盘鲍、南美白对虾、猪和牛的肌肉中均未检测到V型胶原蛋白的阳性反应，推测这是由于不同物种间Ⅴ型胶原蛋白的同源性低导致的结果.当然，这也可能是由于皱纹盘鲍和南美白对虾的肌肉中Ⅴ型胶原蛋白的含量很低所致，具体原因有待进一步的实验验证.有研究发现，在鱼体死后的肌肉软化过程中，胶原蛋白的含量不断降低，肌肉硬度与胶原蛋白的含量及完整性密切相关[2,16].由于传统的胶原蛋白提取分析方法只能获得胶原蛋白含量变化的信息，但不能得到胶原蛋白降解的直接证据.为了研究鱼类冷藏过程中胶原的变化，有必要制备高特异性的抗鱼类胶原蛋白抗体，通过免疫印迹方法并结合肌肉弹性的质构分析，可以更准确地了解胶原蛋白在不同冷藏时间含量的变化情况并揭示其机理.本研究结果表明，制备的抗V型胶原抗体的特异性和效价都比较理想，为后期详细研究鱼类冷藏过程中肌肉软化时Ⅴ型胶原蛋白的降解情况提供可靠的分析方法.【相关文献】[1]蒋挺大,张春萍.胶原蛋白[M].北京:化学工业出版社,2001.[2]SATO K,ANDO M,KUBOTA S,et al.Involvement of type V collagen in softening of fish muscle during short-term chilled storage[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1997,45(2):343-348.[3]连喜军,鲁晓翔,刘勤生.鱼类胶原蛋白研究进展[J].肉类研究,2007,01:46- 49.[4]DEYL Z,MIKSIK A,ECKHARDT A.Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins[J].Journal of Chromatography 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食品酶法提取鱼蛋白质的工艺研究鱼蛋白质是一种重要的食品原料，具有丰富的营养价值和广泛的应用前景。

鱼蛋白质的提取方法多种多样，其中食品酶法提取成为研究热点。

本文将探讨食品酶法提取鱼蛋白质的工艺研究。

1. 食品酶法提取鱼蛋白质的原理食品酶法是通过添加适量酶类来降解鱼肌肉中的结构蛋白，使其变为可溶性鱼蛋白质。

酶类能够特异性地作用于鱼肌肉中的蛋白质，将其水解成各种氨基酸和小肽，从而提高鱼蛋白质的提取率和纯度。

2. 食品酶法提取鱼蛋白质的工艺条件（1）酶类选择：常用的酶类有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和其他微生物来源的蛋白酶等。

选择酶类应根据鱼类的种类和成分特点进行合理选择。

（2）酶解条件：酶解鱼肌肉需控制合适的pH值、温度和酶解时间。

不同酶类和酶解条件对提取效果有着显著影响，需进行优化设计。

（3）酶解辅助物：在酶解过程中，添加一定的助剂可提高酶解效果，如抗氧化剂、蛋白质稳定剂等。

辅助物的选择应综合考虑鱼蛋白质的性质和酶解系统需要。

3. 食品酶法提取鱼蛋白质的优势（1）高效性：食品酶法能够在较短时间内高效提取鱼蛋白质，有效提高提取率和纯度。

（2）无污染：酶类作用下，无需添加化学试剂，对环境无污染。

（3）营养价值保持完整：食品酶法提取鱼蛋白质过程中，酶类特异性作用，仅降解结构蛋白，对其他营养成分影响较小，能够保持鱼蛋白质的营养价值完整。

4. 食品酶法提取鱼蛋白质的应用前景（1）功能性食品：鱼蛋白质具有独特的功能特点，能够为功能性食品提供重要的功能性成分。

（2）食品添加剂：鱼蛋白质可作为食品添加剂，用于改善产品质地、增加口感和营养。

（3）生物医药领域：鱼蛋白质具有生物相容性好、易于吸收等优势，有望成为生物医药领域的重要原料。

总之，食品酶法提取鱼蛋白质是一种高效、无污染且具有广阔应用前景的方法。

随着科技的不断发展和工艺的不断优化，食品酶法在鱼蛋白质提取领域的应用前景将更加广阔，为食品工业的发展和人们的生活健康提供有力支持。