淋巴细胞体外增殖的特点

体外刺激淋巴细胞增殖试验1 样品配制精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。

充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。

2 小鼠淋巴细胞的制备选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。

将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。

吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。

3 细胞培养将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。

于37℃、含5%的CO条件下培养3d，加入相应试剂测定24 淋巴细胞增殖率的测定4.1 Alamarblue试剂测定法在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。

计算公式为：增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%4.2 MTT法测定4.2.1 MTT 溶液的配制方法称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710493447.0(22)申请日 2017.06.26(71)申请人 杭州中赢生物医疗科技有限公司地址 310052 浙江省杭州市滨江区楚天路88号(72)发明人 王冶陶　吴忠福　彭昉　刘慧显　王俊俊　俞英豪　(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/10(2006.01)A61P 33/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 31/18(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用(57)摘要本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用。

所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。

采用本发明培养体系扩增的NK细胞，NK细胞纯度高，对肿瘤细胞杀伤力强，在第14天可以将NK细胞扩增约9100倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；解决了临床应用培养体系的安全性问题，有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。

权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 107177548 A 2017.09.19C N 107177548A1.一种体外扩增淋巴细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：白细胞介素21、白细胞介素12和CD80的混合物。

SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验最佳条件的筛选刘宸铄;刘芳;杨鸣琦【摘要】[目的]探讨磺酰罗丹明B法(Sulforhodamine B,SRB)检测鸡外周血T淋巴细胞增殖反应的最佳条件.[方法]体外培养鸡外周血T淋巴细胞,选用SRB法对淋巴细胞含量(1×105,1×106,2.5×106,5×106,7.5×106和1×107 mL1)、ConA质量浓度(5.0,7.5,10.0,12.5和15.0 μg/mL)、培养时间(36,48,60 h)3个因素进行组合设计培养T淋巴细胞,每个组合设3个重复,SRB显色后用酶标仪在492 nm波长处测量OD492值,计算刺激指数(Stimulation index,SI),筛选SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖的最佳条件.[结果]SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖试验的最佳条件为:淋巴细胞含量1×106 mL-1,ConA质量浓度5.0 μg/mL,培养时间48 h.[结论]确定了体外培养鸡外周血T淋巴细胞增殖的最佳ConA质量浓度、培养时间及淋巴细胞含量,证实用SRB法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖结果可靠,是切实可行的淋巴细胞数量与活性检测方法.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)007【总页数】5页(P15-18,24)【关键词】鸡;外周血T淋巴细胞;细胞增殖;磺酰罗丹明B法【作者】刘宸铄;刘芳;杨鸣琦【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】R446.63;S858.31磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)法是美国国家癌症研究院(NCI)推荐的一种抗癌药物筛选方法，该方法发明于1990年，具有快速、经济、灵敏的特点[1]，其测量结果不受时间影响，如今已广泛应用于细胞数量与活性的检测。

某大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 对显微镜来说，最重要的性能参数是放大倍数。

（）答案：错误解析：显微镜最重要的性能参数是分辨率而不是放大倍数。

放大倍数可根据需要在使用过程中进行调节，可大可小，并不能作为性能参数。

2. 恶性肿瘤的迅速增长是由于细胞周期的时间变短，细胞分裂加快。

（）答案：错误解析：恶性肿瘤的迅速增长是因为肿瘤细失去了最高分裂次数，没有接触抑制现象，从而使得细胞分裂的速度加快。

3. 虽然龟的最高寿命是175岁，而小鼠的寿命只有几年，但它们的细胞在体外培养时分裂的极限基本相同。

（）答案：错误解析：龟细胞体外培养可分裂100次以上，而小鼠细胞在体外分裂的次数一般不超过30次。

4. 146bp的DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体两圈整，并由组蛋白H1锁住核小体DNA的进出端。

（）答案：错误解析：146bp的DNA双螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈；组蛋白H1在核心颗粒外结合额外的20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端。

5. 淋巴细胞在体外培养时是以贴壁的方式进行生长。

（） [中山大学2009研]答案：错误解析：淋巴细胞体外培养时悬浮生长。

6. IP3是PKC系统中的第二信使，它直接激活内质网上的钙泵，动员Ca2＋的释放。

（）答案：错误解析：IP3不能激活钙泵，只能激活内质网膜中的钙离子通道。

7. 高尔基体是一种有极性的细胞器，它的顺面总是在它的凸面。

（）答案：错误解析：高尔基体是一种有极性的细胞器，靠近细胞核的一面扁囊弯曲成凸面被称为顺面，但顺面并非总是在高尔基体的凸面，在细胞发育的某个阶段可能位于高尔基体的凹面。

8. 在内质网，脂质合成的部位和催化糖基化的部位都位于内质网腔面的一侧。

《第2章细胞工程》第2节动物细胞工程二动物细胞融合技术与单克隆抗体必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一动物细胞融合技术1．动物细胞融合技术：是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。

融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

细胞融合的实质是核融合。

2．原理：动物细胞融合的基本原理为细胞膜的流动性。

3．诱导融合的方法(1)化学方法：PEG融合法。

(2)物理方法：电融合法。

(3)生物方法：灭活病毒诱导法。

4．过程：具有不同遗传信息的两个或多个细胞杂交。

5．结果：形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。

6．意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。

这一技术成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。

如利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。

必会知识二单克隆抗体及其应用1．传统抗体的获得(1)方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。

(2)缺陷：制备的抗体产量低、纯度低以及特异性差。

2．单克隆抗体的制备：单克隆抗体是由单一杂交瘤细胞增殖产生的高度专一的抗体。

(1)制备原理①B淋巴细胞的特点：每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，B淋巴细胞在体外不能无限增殖。

②骨髓瘤细胞的特点：在体外能大量增殖，但不能产生抗体。

③杂交瘤细胞的特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体。

(2)制备过程①制备产生特定抗体的B淋巴细胞：用特定的抗原对小鼠进行免疫处理，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。

②培养骨髓瘤细胞。

③将小鼠的骨髓瘤细胞与从脾中得到的B淋巴细胞融合。

④用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有杂交瘤细胞才能生长。

⑤克隆化培养和抗体检测：对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。

用于淋巴细胞的体外培养方法概述淋巴细胞是免疫系统中的关键细胞之一，其在体内起着重要的免疫调节和免疫应答作用。

为了研究淋巴细胞的生物学特性以及开展相关疾病的研究，需要进行淋巴细胞的体外培养。

本文将介绍一些常用的淋巴细胞体外培养方法，以及培养所需的培养基组分和培养条件等内容。

培养基组分淋巴细胞的体外培养所需的培养基主要包括以下几个组分： 1. 基础培养基：如RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）或DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）等。

2. 补充物质：如胎牛血清（FBS，fetal bovine serum）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）和抗生素等。

胎牛血清可提供细胞生长所需的营养物质和生长因子。

3. 其他生长因子：如人工合成的白细胞介素-2（IL-2）、人工合成的白介素-4（IL-4）等，这些因子能够促进淋巴细胞的增殖和活化。

培养条件淋巴细胞的体外培养需要提供适宜的生长条件，主要包括以下几个方面： 1. 温度：通常在37摄氏度下培养，模拟体内环境。

2. 湿度：保持培养皿内的湿度，可通过在培养箱中加水盘或湿润剂来实现。

3. 氧气含量：一般培养箱中的氧气含量为5-10%，与体内氧气浓度相似。

4. CO2含量：淋巴细胞培养时需提供适量的CO2，维持碳酸盐平衡。

通常用5% CO2气体混合气体供给。

5. pH值：培养基的pH值应维持在7.2-7.4，通过加入缓冲剂（如HEPES）来调节。

培养方法淋巴细胞的体外培养方法有多种，常用的包括以下几种： 1. 悬浮培养法：将淋巴细胞悬浮于培养基中，在无固体基质支持的条件下进行培养。

适用于淋巴细胞增殖和活化研究。

2. 界面培养法：将淋巴细胞悬浮于培养基表面的固体基质上进行培养，如琼脂糖凝胶。

适用于淋巴细胞的增殖和功能鉴定等研究。

3. 体外器官培养法：将淋巴细胞均匀分布在灭菌的器官（如扁桃体或脾脏）上进行培养。

体外培养动物细胞的生长特点。

体外培养动物细胞是一种重要的细胞学研究方法，其生长特点具有以下几个方面：
1. 需要适宜的培养基和环境条件：体外培养动物细胞需要适宜的培养基和环境条件，包括合适的营养成分、温度、湿度、氧气浓度等，以保证其正常生长和繁殖。

2. 增殖速度较快：相比于体内细胞，体外培养动物细胞的增殖速度较快，可以在短时间内大量繁殖，为细胞学研究提供了更多的材料。

3. 细胞形态和功能变化：体外培养动物细胞在不同的培养条件下，其形态和功能可能会发生变化。

例如，细胞形态可能会变得不规则或扁平化，细胞分化和功能可能会受到影响。

4. 容易受到污染：由于体外培养动物细胞需要在培养皿中进行，容易受到外界微生物的污染，因此需要采取一系列的消毒和无菌操作。

5. 需要定期传代：体外培养动物细胞需要定期传代，以维持其健康和增殖能力，否则可能会发生凋亡或细胞突变等现象。

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人的外周血淋巴细胞培养摘要淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。

对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。

每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。

本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。

每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。

但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。

经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。

这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。

本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。

通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。

根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。

关键词人的外周血淋巴细胞染色体低渗溶液核型分析秋水仙素动物细胞体外培养Human Peripheral Blood Lymphocyte CultureAbstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro wholeblood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solutionKaryotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前言细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。