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白菜类作物转基因技术研究进展
成细华;刘凡;姚磊;曹鸣庆
【期刊名称】《首都师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2000(021)002
【摘要】白菜类作物是芸薹属中重要的栽培亚种群,也是重要的蔬菜之一.建立高效可重复的植株再生和遗传转化体系是利用基因工程进行遗传改良所必需的.本文从高频率植株再生体系的建立,DNA直接转移,不依赖于植物细胞或组织培养的农杆菌介导转移,建立在细胞或组织培养基础上的农杆菌介导的转化,转化株后代的遗传行为等方面论述了白菜类作物转基因技术的最新研究进展,并提出了存在的问题和进一步的研究方向.
【总页数】8页(P64-71)
【作者】成细华;刘凡;姚磊;曹鸣庆
【作者单位】首都师范大学生物系;北京市蔬菜研究中心;北京市蔬菜研究中心;北京市蔬菜研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】S634;Q949.72
【相关文献】
1.抗虫转基因白菜类蔬菜作物培育研究进展 [J], 王忠华
2.我国以白菜类作物为代表的芸薹属作物基因组学研究国际领先 [J],
3.根癌农杆菌介导的白菜类作物转化体系研究进展 [J], 尹越;张耀伟;高国栋
4.白菜类蔬菜作物离体再生研究进展 [J], 樊明琴;朱月林;朱茂英;许树成;李焰焰
5.我国以白菜类作物为代表的芸薹属作物基因组学研究取得国际领先地位 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes ）。
根癌农杆菌含有 Ti 质粒。
发根农杆菌含有 Ri 质粒。
根癌农杆菌的 Ti 质粒和发根农杆菌 Ri 质粒都具有一段转移 DNA （transfer DNA ，又称 T-DNA），在农杆菌侵染植物时， T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于 T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和 Ri 质粒上可插入大到甚至 150kb 的外源基因，因此， Ti 质粒和 Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和 Ti 质粒上 T-DNA 以外 Vir 区的基因。
染色体基因包括 chvA 、chvB 、att 、pscA 、chvD 以及 chvB 。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低 pH 和磷酸饥饿情况下提高 VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与 VirA 蛋白共同对 virG 起激活作用。
原始的 Ti 质粒根据其功能的不同，可分为 4 个区：（ 1） T-DNA 区：是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段 DNA ，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与 T-DNA 本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界（LB和RB），它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在， T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA 的右边界在 T-DNA 的整合中对于靶 DNA 位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于 T-DNA 以外的 1 个 30~40 kb 的区域内，该区段编码的基因但对 T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为 Ti 质粒编码毒性基因（vir）。
一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。
白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。
本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。
二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。
- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。
- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。
- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。
2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。
1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。
1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。
1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。
1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。
2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。
3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。
3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。
三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。
2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。
3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。
利用根瘤农杆菌制备转基因植物的方法一、背景介绍1. 转基因植物简介随着生物技术的发展，转基因植物已在农业生产中得到广泛应用。
转基因植物是指将外源基因导入植物基因组，从而赋予植物新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物具有抗病虫害、耐逆境、提高产量等特点，在农业生产中具有重要的应用价值。
2. 根瘤农杆菌简介根瘤农杆菌是一种土壤中常见的细菌，它具有特殊的DNA转移酶，能够将外源基因导入植物细胞核。
根瘤农杆菌被广泛应用于制备转基因植物的过程中。
二、根瘤农杆菌制备转基因植物的方法1. 选择表达载体在利用根瘤农杆菌制备转基因植物的过程中，首先需要选择合适的表达载体。
表达载体是一种携带外源基因并能够在植物细胞内表达的载体。
常用的表达载体包括质粒和农杆菌头部。
2. 构建重组质粒将外源基因插入表达载体中，构建重组质粒。
在构建重组质粒时，需要考虑外源基因的稳定性、表达水平和对植物生长发育的影响。
3. 选择合适的宿主植物选择适合的植物作为宿主植物。
在选择宿主植物时，需要考虑植物的再生能力、组织培养条件和对外源基因的接受性。
4. 根瘤农杆菌介导的遗传转化将构建好的重组质粒介导至根瘤农杆菌中，使其在植物组织中导入外源基因。
通过适当的方法，将根瘤农杆菌转化入宿主植物细胞内，实现外源基因的导入。
5. 诱导再生植株待外源基因在植物细胞内表达后，通过诱导再生植株的方式，培养出带有外源基因的植株。
6. 筛选转基因植株通过对转基因植株进行筛选，筛选出带有目标性状的植株。
筛选过程中，通常使用抗性标记基因或荧光标记基因作为筛选标志。
7. 鉴定转基因植物对转基因植物进行鉴定，确认其确实带有外源基因并且表达稳定。
鉴定方法包括PCR、Southern blot等分子生物学技术和生化分析。
三、根瘤农杆菌制备转基因植物的优势1. 高效性根瘤农杆菌介导的遗传转化具有高效性，能够快速、准确地将外源基因导入植物细胞内。
2. 多样性根瘤农杆菌制备转基因植物的方法适用于多种植物，包括大豆、玉米、水稻等重要农作物。
癌农杆菌介导的转化方法1.根癌农杆菌介导的植物遗传转化常用的根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法有以下三种：（1）叶盘转化法（leaf dish transformation）叶盘转化法是1985 年由Horsch 等发展起来的一种经典的基因转化方法，现在在原来方法的基础上改动较大，主要步骤为：①准备植物受体：用打孔器在消毒或无菌叶片上打孔，将所得圆形叶盘作为农杆菌侵染受体备用。
②侵染菌液制备和侵染：将含有目的基因质粒的农杆菌菌株培养至对数生长期，收集菌液，用1/2MS液体培养基重悬至一定浓度，为侵染菌液。
将准备好的叶盘浸泡在侵染菌液中数分钟，取出侵染过的叶盘，吸干菌液，置于共培养基。
③共培养和选择培养：将侵染过的叶盘在黑暗条件共培养至叶盘周围生长有肉眼可见的菌落时结束共培养，将叶盘转移至含有抑菌剂和选择剂的培养基中进行转化体的选择。
④转化体的获得：对在含有抑菌剂和选择剂的培养基上存活且能生根的植株进行PCR等分子检测，检测的阳性植株为转化体。
叶盘转化法适用于所有能从叶子再生植株的各种植物，改良的叶盘转化法是将侵染的外植体从叶片扩大到茎段、叶柄、胚轴、子叶等。
其优点是重复性高，操作简单，缺点是依赖高效的叶片或其他外植体的再生体系。
采用叶盘转化法时要注意以下技术要点：①由于农杆菌难以侵入叶片或其他外植体的深层部位，所以利用该方法时外植体的创伤部位应该含有大量农杆菌转化敏感的分裂细胞。
如叶脉的功能细胞常常在深层，所以制备叶盘时要避开叶脉，尤其是主脉。
②叶片、胚轴、茎段等外植体在培养过程中会膨大，造成切口边缘上翘或卷曲，使农杆菌侵染过的切面因接触不到培养基而不能生长实现转化，所以接种时要把叶盘等切口边缘轻埋入培养基，同时叶盘以圆形和近圆形为佳。
（2）整体植株接种共感染法该方法是模拟农杆菌天然的感染过程，人为地在植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种或注射到创伤部位或植株体内，从而完成T-DNA 的转移，获得转化体。
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）是一种常用的真菌遗传转化技术，它利用根癌农杆菌作为介导者，将目标DNA转移到真菌细胞中，从而改变真菌的遗传特性。
近年来，ATMT技术在真菌遗传转化研究中得到了广泛应用，并取得了许多进展。
ATMT技术的基本原理是将目标DNA插入到根癌农杆菌的转化质粒中，然后通过存在于转化质粒中的跨界转座系统（T-DNA）将目标DNA转移到真菌细胞中。
跨界转座系统是根癌农杆菌特有的一个DNA片段，可以携带外源基因插入到真菌基因组中的随机位置。
真菌细胞会利用此外源基因来表达目标基因，并产生相应的遗传变化。
ATMT技术的优点之一是转化效率较高，可以成功转化多种真菌。
研究人员已经成功地将ATMT技术应用于多种真菌，包括担子菌门（如酵母菌、拟南芥黄链菌等）、接合菌门（如粘帚菌、丝状菌等）和半知菌门（如滑子菌、刺球菌等）。
ATMT技术也可以用于转化真菌中的不同类型的细胞，包括营养体、分生孢子和菌丝等。
近年来，ATMT技术在真菌遗传转化研究中的进展主要包括以下几个方面：ATMT技术的转化效率得到了极大的提高。
研究人员通过优化转化条件和转化质粒的构建，使ATMT技术的转化效率大幅提高，从而提高了转化真菌的成功率。
ATMT技术在真菌功能基因组学研究中的应用取得了重要进展。
ATMT技术可以通过插入性突变的方式，破坏真菌中的特定基因并观察其对真菌生长、代谢和病原性等特性的影响，从而帮助研究人员深入了解真菌的功能基因组。
ATMT技术的潜力在农业和医学领域也得到了广泛关注。
ATMT技术可以用于改良农作物和药用真菌，使其具有抗性和高产性等优良特性，从而提高农作物和药物的产量和质量。
ATMT技术在真菌遗传转化研究中已取得了显著的进展。
随着该技术的不断改进和优化，相信ATMT技术将在真菌研究和应用中发挥越来越重要的作用。
中国蔬菜 2010（12）：7-13CHINA VEGETABLES白菜类蔬菜转基因研究进展高 丽 崔崇士 屈淑平*（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）摘 要：综述了白菜类蔬菜的抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂、雄性不育、品质改良和筛选标记转基因育种研究现状，分析了转基因白菜研究中存在的问题，并指出未来一段时间对白菜类蔬菜转基因的研究重点仍会停留在建立高频再生体系和摸索其他有效方法上，转基因白菜类蔬菜的基因漂移和对其他非靶生物的影响以及对人类健康有无影响也会是热点研究问题。
关键词：白菜类蔬菜；转基因；研究进展；综述中图分类号：S634 文献标识码：A 文章编号：1000-6346（2010）12-0007-07 Research Progress on Transgenosis Technology of Chinese Cabbage Group GAO Li, CUI Chong-shi, QU Shu-ping*（Horticulture College, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China）Abstract：The essay summarizes the status quo of genetically-modified Chinese cabbage group research in terms of insect-resistance, disease-resistance, stress-resistance, herbicide-resistance, male-sterile, quality improvement and screening marker. It also analyzes the existing problems and points out that the research focus will still remain on establishing regeneration system with high frequency and other effective method. The genetic excursion of transgenic Chinese cabbage group, its influence on other non-target biology and whether it will harm human health will be the hot topics for future research.Key words：Chinese cabbage group; Transgenosis technology; Research progress; Review白菜类蔬菜是十字花科芸薹属中最重要的蔬菜作物，全国各地普遍栽培。
