根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化页PPT文档

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Ti质粒的作用PPT课件

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实验证明
例如：图C中显示的是先在两个蕃茄株的茎基部滴一滴根癌农杆菌的悬浮液，而后分别用针在菌液处刺一个小孔，5周后所拍的照片。图D中显示的是另一个实验结果，先用细菌悬浮液加到新鲜的胡萝卜切面上，两周后可见有绿色的根癌从切片中心维管系统周围的分生组织上长出。
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在自然条件下，根癌农杆菌的可动细胞依靠趋化性向受伤位点靠近。这部分是对根部释放糖和根的其它普通成分的反应，质粒丢失的菌株也应有则强这烈种的情多况。，因然为而质，粒包能含识Ti质别粒伤的流菌中株的的一反些酚类物质如乙酰丁香酮（见图F）。这种物质既使在很低的浓度下也能强烈吸引质粒（107外M的ol/、L）存，在因于此细T胞i质膜粒上的且功使能细之菌一能就识是别编伤码口额的特异性趋化受体。
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T-DNALeabharlann 移如图E中的表中所示，被切下的T—DNA 由细菌释放后然后进入植物细胞。然后整合进植物的染色体并支配这些细胞的功能。这种转移的确切机制仍不是很清楚，但看起来是一个有条件的过程。也许是受细菌产生细胞分裂素（植物激素）所介导。Ti质粒上的tzs（反式玉米素）基因编码这种激素。
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根癌农杆菌C58菌株中Ti质粒上的一些主要功能区示图
T-DNA = 可转移 DNA; Noc =烟脂碱合成基因; Ori = 质粒复制起点; Con = 制约质粒通过接舍作用转移到其它农杆菌菌系的区域; Acc =农杆碱代谢基因; tzs = 反式玉米素合成基因; Vir = 毒性基因.
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侵染
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Ti质粒编码一种嵌在细菌细胞膜上的营养吸收蛋白根癌碱（opine)透酶的基因，这种质粒同时也能拷贝和切下它自已的部分DNA，并使之进入植物细胞从而使植物产生根癌碱。

农杆菌转化法基本操作与理论课件

二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。
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农杆菌介导转化法
08-1
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。

农杆菌转化原理及技术 PPT

愈伤诱导
NB培养基为基本培养基加入相应植物生长调节
剂
共培养
整个操作过程约需8天
第一天（预培养）第三天（划菌）第五天（侵染、共培养) 第八天（脱菌、筛选）
抗性愈伤的筛选与再生成完整植株
技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继代次数不超过8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（2-3次筛选）；迅速分化再生。
Ti plasm id w ith the new gene
+
cell’s DNA
A g ro b a cteriu m
Plant cell
Transform ation
The new gene
Transgenic plant
C ell division农菌介导转化水稻的方法水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程
❖ Vir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH 等七个操纵子共24个基因起共调控作用。
Ti质粒结构示意图
农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒（Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区（Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
❖ T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是核心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连续的两组，是完全保守的。

根癌农杆菌

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根瘤菌科，农杆菌属
（Agrobacterium）：
——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入植物基因组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状不定根，干扰植物的正常生长
－根癌农杆菌（A. tumefaciens）
Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用）
纯化和稳定遗传－不需要特殊的专用设备
缺点：－只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没
有方向性
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也称微弹轰击法：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源 DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，从而实现基因的转化。
可将基因枪分为三种类型：第一类是以火药作为动力；第二类是以高压气体作为动力；第三类是以高压放电作为动力。
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杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理
当昆虫吞食后，ICP在昆虫中肠的碱性消化液和胰蛋白酶作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水死亡。
由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响。
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基因枪
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1) 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因矮牵牛等；
2) 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、乙肝疫苗、表皮生长因子等；
3) 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中的作用
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Bt能杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素（杀虫晶体蛋白， Bt）。

农杆菌转化法基本操作与理论ppt课件

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二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。
农杆菌介导转化法
生物技术08-1 梁荣洪
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一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
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5Байду номын сангаас
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三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。

植物基因转化PPT课件

C、双元载体 • 利用两个载体分别提供T-DAN区域（卸甲的）和毒性功能
第20页/共29页
克隆载体
辅助质粒
共存于同一个农杆菌中，再由农杆菌完成目的基因向植物基因组的转移
第21页/共29页
四、其它DNA转化植物的方法
（一）原生质体转化（二）基因枪（三）整株植物转化（四）叶绿体转化
第23页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
3、载体类型
B、共整合载体（Cointegratevectors）
由两个部分组成：
一个缺失了T-DNA上的肿瘤诱导基因的Ti质粒一个中间载体（intermediate vector）组成（一种在普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适的T-DNA片断，而构成的小型质粒）。
（二）、致瘤Ti质粒
200 kb
第5页/共29页
根癌农-250kb，以下几个功能区
• 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 • 冠瘿碱代谢区 • Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移 • 毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体 • DNA复制区（Rep）：参与Ti 质粒DNA复制
第6页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化
（三）、 T-DNA 的转化 1、T－DNA的结构 • 是Ti质粒中转移到植物细胞中的部分，内含冠瘿碱合成和植物
激素合成相关的基因 • A. tumefaciens 利用冠瘿碱作为生长的碳源 • 左和右边界
➢T-DNA的左边界和右边界是T-DNA 从Ti 质粒切开的位点 ➢边界包含25 碱基的重复元件 ➢只有右边界是转移所必须的，但在克隆载体中，均含有两个边界
第11页/共29页
根癌农杆菌介导的遗传转化

根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化

三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长；具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生质体再生困难，获得转化株少，操作比较复杂。
• 叶盘转化法 • 优点：适用性广；改良的叶盘法可以适用于其它外植体如茎段、子叶等；操作简单且重复性高。 • 注意事项：掌握叶组织侵入农杆菌培养液的适宜时间；叶片在培养过程中常膨大而扭曲，可把切口边缘压入埋藏在培养基中；制备叶盘是最好避免叶脉进入。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
• 该转化系统是模仿天然的转化载体系统，成功率高，效果好； • 机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广泛； • Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入，目前已把50kb的DNA转入植物细胞中； • 农杆菌Ti质粒转化系统的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，且多数符合孟德尔遗传规律。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染领域。
二、根癌农杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
农杆菌附着后不能立即转化只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤因此共培养时间必须长于16h时间过长由于农杆菌的过度生长植物细胞因受到毒害而死亡
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化

目的基因的转化和其原理课件

（3）Con区（regions encoding conjugations）该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti
质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication）该区段基因调控Ti质粒学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2、植物基因工程载体的种类及特性
植物基因工程载体
克隆载体中间载体卸甲载体
转化载体
中间克隆载体
中间表达载体 onc-
中间黏粒载体质粒/黏粒载体基因标记载体
onc+
一元转化载体（顺式载体）
双元转化载体（反式式载体）
T-DNA区细胞分裂素基因
结合转移区生长素基因
冠瘿碱代谢
复制起始区
冠瘿碱合成
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文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2. Ti质粒的功能区域
• Ti质粒可分为四个区：
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下
共整合载体
SEV（拼接末端载体； split-end vector）
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文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
• 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 • 2、T-DNA的基因结构与功能 • 3、Vir区操纵子的基因结构与功能
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3
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示， • 如：leu （亮氨酸基因位点）

转基因动植物ppt课件

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第二节构建转基因的农作物
提高农作物质量和产量的有两方法。一是杂交育种，但不可能将所有的优良性状组合到一种植物中。二是用杀虫剂和除草剂。长期使用化学药物会导致环境的破坏。而用转基因的方法能克服以上的问题。达到增加产量，改进质量并可抗病虫害以及抗干旱、盐碱等。有两种产生转基因农作物的常用方法：（1）通过根癌农杆菌的Ti质粒转化双子叶植物；（2）用基因抢等装置发出高速粒子轰击单子叶植物等。
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一、P因子介导的转化
转座因子含有两个功能区：
（1）转座因子两端的DNA重复序列，此是整合和切离所需要的；
（2）编码转座酶的DNA序列，此是转座所需要的。
A.Spradling 和G.Rubin根据在其他系统中转座因子的研究，论述了克隆的P因子序列可用于构建果蝇的表达载体，诱导克隆的DNA的“终末”转座到果蝇的生殖细胞中。他们使用的技术是用鉴别转座基因的标记基因和待测定的实验基因取代克隆P因子中的转座酶编码序列。
SB是水手转座因子超家族中的一员，长1.6kb, 两侧是 231bp的IR。中央区编码一个转座酶和DNA识别区。它能够将自己插入到基因或基因之间，活化或关闭一个基因的正常功能。实验证明，SB能将外源基因插入到脊椎动物培养细胞中，包括小鼠的胚胎干细胞及人类细胞。
转座因子睡美人的结构特点
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（三）、PB(piggy back )因子
（1）T-DNA，携带植物激素基因和章鱼碱基因；
（2）是毒性基因vir
(virulence)区域。
（3）携带接合基因，与细菌间质粒的转移有关。
（4）编码功能与冠缨碱利用有关。
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天然的Ti质粒不能使用。（1）可产生肿瘤。

植物细胞转基因技术幻灯片PPT

基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，最后整合到植物基因组并得以表达从而实现基因转化的方法。1992 年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头特制手枪
射击植物
优点：抑制了受体材料的限制，不必制备原生质体。实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。缺点：进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。
固
➢ 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处
理
➢ 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固
着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进展操作。
优点：
转化率高，特别是在没有适宜的DNA载体系统时更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接受位点
受体不用特殊的选择系统
可以控制转移的量和转移物的浓度
DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法和花粉管通道法。
➢基因枪法 ➢电击法 ➢花粉管通道法 ➢化学物质诱导法 ➢显微注射法 ➢脂质体法
1.基因枪法
利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的转基因植株。
4.化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特
定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG

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根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
学生：贾俊忠学号：2019103070
一.根癌农杆菌的生物学特性 • 农杆菌细胞呈杆状，以1－4根周生鞭毛进行
运动。农杆菌侵染时，细菌通过原有的病斑或伤口进入宿主组织，但细菌本身不进入宿主植物细胞，只是把Ti质粒的DNA片段导入植物细胞的基因组中； • 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，对单子叶植物不很敏感。
二、根癌农杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
根癌农杆菌的制备
• 农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用。
• 农杆菌的培养：
1）培养基：目前常用的农杆菌培养基有LB、YEB、 YEM、TY、PA、523等，其中LB、YEB、YEM、523属富集培养基，是常用的制备工程菌液的培养基；PA和TY 是常用的农杆菌选择培养时的培养基。
2）田间取材通过预培养起驯化作用，使外植体适应于试管离体培养条件，保持活跃的生长代谢状态；
3）减少外植体转化过程中的杂菌污染率；
• 有利于侵染接种的外植体能与培养基平整接触；
• 外植体的预培养时间和培养效果有明显关系，一般 2－3天为宜。
外植体的农杆菌接种
• 掌握外植体在菌液中浸泡的时间，一般控制在数秒至数分，以叶盘边缘充分湿润为度，不要超过30分钟；
• 选择的方法及时期• 根据择和再生的关系分两种：一种是先再生后选择，弊端是嵌合体严重，假转化体多，后期选择纯化困难；另一种是先选择后再生，转化体少，但嵌合体少，假转化体少，转化体纯化方便。
•
根据选择压加入的时期不同，分为前期选择、延迟选择和后期选择。
• 选择培养过程中转化和再生细胞的一致性
• 在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是否一致，关系到能否得到真正的转会体，只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有可能分化成转基因植株。
• 假转化体产生的原因：1）外植体的再生部位与选择培养基未充分接触，选择压不起作用；2）转化细胞对非转化细胞的滋养作用；3）转移T-DNA未整合，只是瞬时表达；4）生理性抗性植株。
2）农杆菌的生长条件：农杆菌培养分为固体平板培养和液体振荡培养，固体培养一般需2－3天，液体培养一般需1－2天，25－30度；当细菌增长达对数生长期，可以稀释培养或储存于4度冰箱；用光密度测
定法测定农杆菌浓度。
Vir区基因活化诱导物的使用
• Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对vir区基因的活化具有重要作用，常用的诱导物是乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮；
• 不同外植体与农杆菌的最佳共培养时间不同。
• 农杆菌的增殖适度 • 共培养中农杆菌的增殖适度直接与转
化有关，农杆菌增殖和生长状态与其侵染能力相关。 • 控制农杆菌增殖的方法：
1）调整工程菌的浓度； 2）控制共培养时间； 3）使用抗生素调控农杆菌的增殖生长。
外植体脱菌及选择培养
• 外植体的脱菌培养所谓脱菌培养，就是把共培养的外植体转
• 转化外植体的选择原则： 1）以叶片、子叶、胚轴为首选材料； 2）要注意外植体年龄，选择幼年的外
植体； 3）以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外
植体应考虑其转化的最佳感受期； 4）应考虑感受太细胞在外植体的部位
。
外植体的预培养、接种及共培养
• 外植体的预培养作用：
1）促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合外源DNA；
• 菌液浓度对不同植物的外植体有一定差异，一般浓度范围OD600＝0.05-0.7之间；
• 浸泡后的外植体在滤纸上吸干要适度。
农杆菌与外植体的共培养
• 最佳共培养时间：农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，因此，共培养时间必须长于16h，时间过长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗
的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长；具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生质体再生困难，获得转化株少，操作比较复杂。
移到含抗生素的培养基上培养。 • 脱菌的抗生素：常用的脱菌抗生素有羧苄
青霉素、头孢霉素等；使用原则是在达到抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓度。 • 脱菌培养时间：脱菌培养的时间一般需5－ 6次继代培养，有的一直使用抗生素，直到
试管苗形成。
• 转化体的选择培养
• 选择压：抗生素加入培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，即为选择压。加入的抗生素浓度越大，选择压也越大。选择压的强度应根据植物的特性而定，一般浓度范围Km为50－100mg/L； htp为10－20 mg/L ，ppt为5－20 mg/L 。
根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理
• 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号；
• 这些化学诱导物通过农杆菌的细胞膜，活化virA和 virG基因，再诱导vir区的其他基因；
• vir基因的活化，作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移； • T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上； • T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素； • 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因，分解
• 诱导物的采用三种方法：1）在农杆菌液体培养基时加AS，加入时间在制备工程菌侵染液前4－6小时加入；2）AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中；3）在农杆菌液体培养基中和共培养基中都加入AS。
• 含AS的培养基PH值为5.0-5.6时，vir区基因的诱导达最高水平。
外植体的选择
• 通过对不同外植体转化成功的实例分析，叶片（叶柄）为35％、子叶为9％、胚轴为10％、茎为17％。
植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源； • 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti
质粒的接合转移，扩大侵染范围。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染领域。