根癌农杆菌介导法

根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究作者：李砚川来源：《湖北农业科学》2011年第17期摘要：以小麦栽培品种郑麦９０２３成熟胚半胚愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌菌株ＧＶ３１０１将目的基因导入受体材料并对转化过程进行了优化。

考查了ＭＳ培养基中ＮＨ４ＮＯ３浓度对组织培养的影响，以及高渗处理对转化过程的作用。

结果显示，２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３浓度可明显提高愈伤组织再生率，高渗处理对愈伤组织再生率的提高也有帮助。

经抗性筛选和ＰＣＲ鉴定，共得到了４株转基因小麦植株，平均转化效率为０．１８％。

关键词：小麦；成熟胚；农杆菌；转化中图分类号：Ｓ５１２．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）17－3637-03Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＭａｔｕｒｅＥｍｂｒｙｏＴｉｓｓｕｅｓＬＩＹａｎ－ｃｈｕａｎ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅ Sciences ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ by Agrobacteroum strain GV3101 ｕｓｉｎｇｅｘｐｌａｎｔｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｗｈｅａｔｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆＺｈｅｎｇｍａｉ９０２３ａｓｒｅｃｅｐｔｏｒ；ａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ 2.5 times ｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｃould ｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ callus．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲ identification，４ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｖｅｒａｇｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ of ０．１８％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｈｅａｔ；ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ１９９７年，Ｃｈｅｎｇ等［１］首次用农杆菌介导法获得可育的转基因小麦植株。

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

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根癌农杆菌介导的真菌转化(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。

2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。

3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。

4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。

5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。

6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。

b电击转化1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。

2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。

3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。

4)于28℃，220rpm，2-3h。

5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。

(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl27)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation1)Thawcompetentcellsonice.2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroomtemperaturefor2-3days.(三）农杆菌介导的真菌转化1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。

下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。

T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。

不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。

置于该边界内的任何外源基因均可被转化。

LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。

LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。

其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。

该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。

3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。

它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。

根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。

它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。

本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。

根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。

它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。

2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。

2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。

3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。

4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。

根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。

1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。

转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。

•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。

•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。

2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。

通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。

•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。

T-DNA插入突变具有受体材料范围广、操作简便、转化效率高、插入拷贝数少,转化子稳定等优点，是目前标记和获得植物病原真菌功能基因组的最有效的途径之一。

T-DNA插入突变也叫T-DNA标签(tagging)、(Agrobacterium tumefaciens 一mediated transformation，ATMT)，是根癌农杆菌介导的利用T-DNA作为插入突变原或分子标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究其基因功能的方法。

所谓的根癌农杆菌是指侵染植物根部的能诱发植物产生肿瘤的革兰氏阴性细菌，它们在自然状态下趋化性感染大多数双子叶植物的受伤部位，继而侵入根部细胞，最后在其中裂解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段便会与植物细胞的核基因组整合，合成正常植株所没有的冠瘿碱(opines)，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转为癌细胞并诱导其产生冠瘿瘤。

1974年，比利时根特大学遗传学实验室的Zaenen观察到了农杆菌中的巨型质粒，并首次命名为Ti质粒。

后来发现这个约200kb的环状Ti质粒，主要包括毒性区(Vir区)、转移DNA 区(T-DNA区)、接合转移区和复制起始区这四个区域。

它能从致病植株转移到无病的植株中，使正常植株致病，T-DNA转移要穿越植物和细菌的细胞壁，再经过其原生质膜，最后穿透核膜。

主要包括4个过程：1)农杆菌首先识别植物敏感细胞再进行吸附和对信号的感受；2)Ti质粒上vir基因的激活；3) T-DNA切割以及T-DNA复合物的形成；4)新形成的T-DNA复合物从农杆菌转移到植物细胞中；5)整合T-DNA到植物的核基因并开始表达。

整个过程中，T-DNA自身并不编码任何与转移及整合有关的酶。

ATMT技术正是利用这一特性来携带外来基因进入植物细胞。

由于T-DNA两端各有一段25 bp的相对保守的同向重复序列，即T-DNA 边界序列。

将要转入植物细胞核的外源目的基因就是通过质粒构建的方法连接于这两段DNA区域之间。

实验七 农杆菌介导法转化烟草一、实验目的（1）了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤。

（2）掌握遗传转化的基本操作技术。

二、实验原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。

野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。

农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。

我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

三、材料、器材与药品1、材料烟草、LBA4404菌株质粒载体为pBi1212、器材摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。

3、药品MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA。

四、实验步骤1、根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在 YEP 固体培养基上，YEP 固体培养基的成分为每100ml含NaCl 0.5g、酵母 1g、水解酪蛋白 1g、琼脂 1．5g、pH7．0。

在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。

2、配制 YEP 液体培养基：成分同上，只是添加卡那霉素而不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5ml左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。

3、摇菌：用灭菌的牙签或者火柴棍等挑出单菌落，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于27℃摇床上摇菌16-17h（180r/min） ，培养至 OD600为 0．6～0．8。

实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。

自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。

农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。

农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。

简略地说。

其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。

・综述与专论・生物技术通报Ｂ１０ＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹＢＵＬＬＥＴｌＮ２０１０年第３期根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展范亮波李梅冀颖刘卫德蒋细良（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京１０００８１）摘要：木霉作为土传植物病原茵的生防真菌，研究其功能基因具有重要的意义。

根癌农杆茵介导的遗传转化（ＡＴＭＴ）为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。

对根癌农杆茵介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。

关键词：根癌农杆茵木霉茵遗传转化Ｔ・ＤＮＡＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＭｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＦａｎＬｉａｎｇｂｏＬｉＭｅｉｊｉＹｉｎｇＬｉｕＷｅｉｄｅＪｉａｎｇＸｉｌｉａｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ如ｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｇａｉｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｔｏａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓｏｉｌ－ｂｏｒｎｅｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓａｎｄｉｔｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｉｔ＇ｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｆｏｒｗｈｉｃｈＡＴＭＴｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔ００１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｎｓ—ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＴ・ＤＮＡ木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，是一种广泛存在于土壤中的丝状真菌。

应用与环境生物学报 2007,13(6):868~871Chi n J App lEnvi ron B i o l =ISSN 1006-687X2007-12-25收稿日期:2006-11-21 接受日期:2007-02-12*国家自然科学基金(N o .30570142)、江苏省青年科技创新人才(学术带头人)基金(BK2006504)及及教育部长江学者和创新团队发展计划资助(I RT0532)资助 Supported by t he National Nat u ral S ci ence Foundati on of Ch i na (No .30570142),the You t h Scientific and Techno -l og i ca l Innovation Foundation of Ji angsu ,Ch i na and t h e P rogra m for C hangjiang Scholars and Innovati ve Res earch Tea m i n Un i versit y ofC h i na (I RT0532)**通讯作者 Correspond i ng author (E -m ai :l raoz m@yahoo .co m.c n )根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化*饶志明1**张君胜1,2沈微1 方慧英1 诸葛健1(1江南大学工业生物技术教育部重点实验室和工业微生物中心 江苏无锡 214036)(2江苏畜牧兽医职业技术学院 江苏泰州 225300)摘 要 通过构建质粒pCAM 3300-zeocin ,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pC AM 3300-zeocin 的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candi da glycerinogenes )W L2002-5共培养,利用z eoci n 抗性基因为筛选标记,实现了pCAM 3300-z eoci n 对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h ,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1B (500~1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.图3表2参12关键词 产甘油假丝酵母;转化;根癌农杆菌;zeocin 基因CLC Q 75:TQ 923Geneti c T ransfor m ation of Industrialized Strai n Cand i da g l yceri nogenesby Agrobacteri u m t u m efaciens*RAO Zhim i n g1**,Z HANG Junsheng 1,2,SHEN W e i 1,FANG H u i y i n g 1&Z HUGE Jian1(1K e y L aboratory of Indu st rial B iot echnol ogy,M inistry of Educa ti on,R ese arc h Cen t er of Industri a lM i croorg an is m s ,J i angnan Un iversit y ,W ux i214122,Jiangsu ,Ch i n a)(2Ji ang s u A ni ma lH u sband ry and Ve t erina ry Colle g e ,T ai zhou 225300,J i angs u,C h i na)Abstract In th i s resea rch ,the plas m id p CAM 3300-zeo cin was constructed and transf o r m ed i nto Agrobacter i um t umefaciens .The A.t u m efaciens con tai n i ng t he b i nary vector pCAM 3300-z eoci n w as co -cultivated w ith i ndustrialized stra i n Cand i da g l y cero logenes is W L 2002-5.T hen ,transfor m ants w ere screened on a plate conta i n i ng 150m g /L Z eo ci n .PCR results demon -stra ted t hat zeocin gene w as i ntegrated i nto nuclear genom e of C.glycerologenesis .R esearch results i ndicated tha t z eoci n gene cou l d be utilized as se l ec ti on m arker and the Z eoc i n coul d be used as selecti on pressure i n transfo r ma ti on o f C.g l y cero logene -sis .A cco rd i ng to the gro w th charac teristi cs o f C .g l y cero logenesis ,t he transfor m ation conditi ons were furt her opti m ized .T he re -sults show ed t hat the transfor m ation e ffi c iency cou l d reach t w o trasfor m ants per 104C.gl y cero logenesis cellw hen cocu lti vation ti m e re m a i ned 24hours and cell rati o o f C.g l y cero logenes is and A.tu m efaciens w as 1B 500~1000.The successf u lly construc -ted transfor m ation sy stem of C.gly cerologenesis by A.tu m efaciens can prov i de a pow erful too l f o r f urther research o f foreign g enes expressi on i n C.glycerologenesis .F i g 3,T ab 2,R e f 12K eyword s Agrobacteriu m tu m efaciens ;Candida gl y cerinogenes ;genetic transfo r ma ti on ;zerci n g ene CLC Q 75:TQ 923转化是酵母基因操作中的重要步骤之一.1978年H i n -nen [1]和B eggs [2]首次报道应用原生质体法将质粒成功转入酿酒酵母.目前广泛采用的酵母转化方法主要有原生质体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法等,这些方法在酵母的遗传转化研究上已取得了巨大的成功[3].但是它们在转化工业化生产菌株产甘油假丝酵母时遇到了很大的困难.根癌农杆菌介导的遗传转化以其操作简单、转化率高、转基因低拷贝、易于得到稳定的转化子等特点,被广泛的应用于植物的基因转化.Bundo -ck 等[4]于1995年首次成功实现了根癌农杆菌介导酿酒酵母的遗传转化.耐高渗产甘油假丝酵母(Cand i da g l y cerinog enes )W L 2002-5是江南大学工业微生物研究中心的科技工作者经过30余年的潜心研究获得的工业化生产甘油的优良菌株.产甘油假丝酵母除了具有甘油产率高、耐高渗、生长快、发酵原料简单等优点,还能产生多种其他多元醇,如赤藓醇、D -阿拉伯醇和甘露醇等,因此是一类应用价值极高的酵母[5].采用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能的重要途径,实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法,在此基础上才有可能对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造,以达到提高甘油产量和改善工艺的目的.因此,建立产甘油假丝酵母的遗传转化体系具有重要意义.常规的酵母转化方法转化产甘油假丝酵母未有成功报道.在作者成功建立根癌农杆菌转化酿酒酵母方法的基础上[6],本研究尝试了采用根癌农杆菌转化产甘油假丝酵母的可行性;并针对产甘油假丝酵母生长较快的特点结合本研究的转化方法对转化条件进行了适当的优化.1材料与方法1.1菌株和质粒根癌农杆菌LBA4404含利福霉素及链霉素抗性为本研究室保藏,耐高渗产甘油假丝酵母W L2002-5为本研究室保藏.质粒pCAM3300,含卡那霉素抗性由中国水稻研究所馈赠. zeocin抗性基因由本研究室工作人员从质粒pP I CZB上克隆得到,质粒pP I CZB购自Inv itrogen公司.pEGM-T-easy vector试剂盒为P rom eg a公司产品.1.2工具酶和试剂实验中的各种酶、氨基酸营养因子和抗生素(头孢噻肟除外)均购自上海华美生物工程公司,头孢噻肟和乙酰丁香酮(A cetosyr i ngone,A S)购自Sig m a公司,抗生素Zeoc i n购自上海普飞生物科技有限公司,质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自博大泰克,T r i s、CTAB、SDS购自S i gm a公司,其他化学试剂均为国产分析纯.1.3培养基LB培养基(Q/g L-1):蛋白胨10100、酵母膏5100、氯化钠10100;Y PD培养基(Q/g L-1):蛋白胨20100、酵母膏10100、葡萄糖20100;S M培养基(选择培养基)(Q/g L-1):酵母氮基6170、葡萄糖20100;p H610.MM培养基(基本培养基)、I M 培养基(诱导培养基)见文献[7,8].1.4根癌农杆菌的转化将含有zeo cin基因的质粒pCAM3300-zeocin通过电击法转化到根癌农杆菌LBA4404中.在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证.根癌农杆菌感受态的制备及转化方法见参考文献[7],根癌农杆菌质粒提取方法见参考文献[9].1.5根癌农杆菌T i质粒转化产甘油假丝酵母根癌农杆菌T i质粒转化产甘油假丝酵母的方法参考文献[10]并有所改进.接种含有质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌LBA4404于LB培养基(卡那霉素50L g/mL,利福霉素50 L g/mL,链霉素30L g/mL)中,30e,200r/m i n摇床培养36 h,离心收集菌体,用等体积的I M培养基重悬,培养6h;接种产甘油假丝酵母于Y PD培养基中,30e,200r/m i n摇床培养过夜;产甘油假丝酵母的Y PD培养液按1B5稀释到YPD新鲜培养基中,培养6h.分别离心收集产甘油假丝酵母和根癌农杆菌菌体,用生理盐水清洗一次,用I M培养基重悬菌体,产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL,根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL,各取50L L加入20mL I M培养基(乙酰丁香酮200L m o l/L,卡那霉素50L g/mL,利福霉素50L g/mL)中30e,200r/m i n培养过夜.取200L L培养液涂布到铺有玻璃纸的I M+A S固体培养基平板置于25e培养24h;将玻璃纸转接到S M培养基(头孢噻肟200L m o l/L,Zoec i n150m g/L)上培养2d,筛选阳性酵母转化子.1.6产甘油假丝酵母阳性转化子表型验证将筛选的阳性转化子和产甘油假丝酵母同时在S M培养基(Z oeci n150m g/L)上划线30e培养24h后观察生长情况.1.7产甘油假丝酵母阳性转化子染色体的提取及PCR验证经过初步筛选的产甘油假丝酵母阳性转化子进行染色体提取和PCR验证.产甘油假丝酵母染色体的提取参考参考文献[11].根据z eoci n基因的特异性设计引物:引物F:5p-ATGGC-C AAGTTGA CCAGTGCCGTTC-3p;引物R:5p-GTCAGTCCT-GCT CCTCGGCCA CGAAG-3p.用该对引物在特定条件下扩增产甘油假丝假丝酵母染色体没有条带,扩增zeocin基因会得到大小为300bp的DNA片段.酵母18S r DNA两端引物:引物F:5p-ACCGGAATTCG-GCAGGGACGTAATCAACG C-3p;引物R:5p-ACCGGAATTCGC-CTGAGAAA CGGCTA CCAC-3p.PCR反应条件为:95e5m i n,94e变性50s,52e退火115m i n,72e延伸1m in,经过30个循环后,72e延伸10 m i n.PCR扩增产物用115%的琼脂糖凝胶电泳检测.1.8产甘油假丝酵母转化子稳定性验证将阳性转化子在YPD培养基斜面培养,24h后挑取菌落再次在YPD斜面培养基上划线培养.每转接一次定义为一代.转接10代以后挑取菌落接种于S M培养基(含Zoec i n150m g/ L)和YPD培养基对照实验,并提取染色体PCR验证.1.9转化条件优化策略1.9.1I M固体培养基诱导共培养时间优化取培养过夜的I M培养液,适当稀释涂布I M固体培养基,共培养0、12、18、24、30、36、40h将玻璃纸平行转移到S M固体培养基进行筛选培养,观察S M平板上转化子的生长情况.同时对I M培养液进行酵母菌落计数,计算转化率.1.9.2共培养根癌农杆菌菌体量优化取109个/mL的酵母细胞10L L,和1011个/mL的根癌农杆菌细胞1、10、50、100、200、500L L混匀共培养,筛选阳性转化子并计算转化率.2结果与讨论2.1质粒pC AM3300-zeocin的构建及酶切验证质粒的构建如图1,分别提取质粒pCAM3300、T-zeocin,经过E co RÑ酶切,胶回收zeocin基因和线性pCAM3300;在T4图1重组质粒pCA M3300-zeoc i n的构建Fi g.1C onstru cti on of reco m b i nant p l as m i d pCAM3300-zeoci n8696期饶志明等:根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化DNA 连接酶的作用下连接得到p CAM 3300-z eoci n .质粒p CAM 3300-zeocin 的酶切验证见图2,质粒p CAM 3300-z eoci n 经过Eco R Ñ酶切,切下了112kb 大小的片段,与预期的zeocin 基因大小一致,说明z eoci n 基因已成功地连入了载体pCAM 3300.2.2 根癌农杆菌阳性转化子的获得将在抗性平板上挑取的阳性根癌农杆菌转化子在液体LB 培养基(卡那霉素50L g /L )中培养24h 后提取质粒,将得到的质粒进行酶切验证(同图2未列出),证明已得到了含有质粒pCAM 3300-zeocin 的根癌农杆菌.图2 质粒pCA M 3300-zeoc i n 酶切验证Fi g .2 En z y m ati c d i gesti on of pCAM 3300-zeoci n1.T -zeocin /E co R Ñ;2.DL2000;3.zeoc i n /E co R Ñ;4.pCAM 3300/E c o R Ñ;5.pCA M 3300-zeoci n /Eco R Ñ;6.pCAM 3300-zeoci n /Bam H Ñ;7.K DNA /H in d Ó2.3 产甘油假丝酵母转化子的获得及初步鉴定在I M 培养基上共培养1d ;然后转移到S M 培养基(头孢噻肟200L m o l/L )上培养1d ,已经可以看到中间长出许多的酵母单菌落.挑取长势较好的酵母菌落,在S M 培养基上划线,30e 培养1d 后菌落生长良好的转化子可以初步确认为阳性转化子,转化子命名为Cand i da glycerinogenes-zeo cin (C .g -z).在产甘油假丝酵母的转化研究中,发现由于产甘油假丝酵母生长迅速,在I M 平板上诱导培养达到36h 时候产甘油假丝酵母菌落就已经长满I M 平板,无法进行后期抗性转化子的选择工作,因此我们对I M 固体培养基最佳诱导共培养时间进行了研究.2.4 产甘油假丝酵母转化子PCR 验证将初步确认的产甘油假丝酵母阳性转化子接中于Y PD 液体培养基中,30e ,200r/m i n 培养18h ,提取染色体进行PCR 鉴定,同时作阴性对照,琼脂糖凝胶电泳见图3.从图中可以看出,阳性转化子中可以扩增出zeocin 基因的特异性片断,而阴性对照染色体中无法扩增出该特异性片段,但产甘油假丝酵母染色体可以扩增得到18S rDNA 基因片段,说明产甘油假丝酵母的染色体是可以用于扩增的.由于产甘油假丝酵母染色体上不含有zeocin 基因,因此产甘油假丝酵母染色体无法扩增出zeocin 基因,而阳性转化子可以扩增得到zeoci n 基因,说明转化子中已含有了z eoci n 基因.PCR 鉴定的结果初步表明通过根癌农杆菌介导转化的方法已实现了zeocin 基因对产甘油假丝酵母转化.图3 阳性转化子PCR 验证Fig .3 PCR results of positive trans f or m ants1.zoecin 基因的特异扩增;2.DNA M arkerDL2000;3、4、5、6.阳性转化子zoe c i n 基因特异扩增;7.产甘油假丝酵母zoecin 基因特异扩增;8.产甘油假丝酵母18S r DNA 扩增1.Am p lified p roduct of zeoc i n gene ;2.DNA m ark er DL2000;3,4,5and 6.Amp lifi ed produ cts of positive trans f or m ants w ith p ri m ers of zeocin gene ;7.Amp lifi ed p roduct fro m geno m i c DNA of host strai n w it h pri m ers of zeoci n gene ;8.Am pli fi ed produ ct fro m geno m i c DNA ofh ost strai n w ith pri m ers of 18S r DNA2.5 转化条件优化结果在不同诱导共培养时间下产甘油假丝酵母的转化率见表1.从表1结果中可见,随着诱导时间的增加转化率也在增加.说明产甘油假丝酵母在根农杆菌介导的转化中,随着诱导时间的增加T i 质粒T-DNA 进入酵母细胞的几率增加.试验中发现,由于产甘油假丝酵母生长迅速,随着诱导共培养时间增加,当在I M 培养基上共培养达到30h 的时候产甘油假丝酵母就已经开始在玻璃纸上形成菌落,这时候再向S M 平板上转移玻璃纸,在S M 平板上转化子很难分辨,这对后期玻璃纸转移后的筛选增加了难度.而当共培养时间为36h 时在S M 培养基上则无法辨认转化子.因此应用这种筛选方法最佳的诱导共培养时间应该在18~24h 之间,不应超过24h .表1 不同共培养时间对转化率的影响T ab l e 1 E ffect o f cocu lti vation ti m e on transforma ti on effic i ency共培养时间Coculti va ti on ti m e (t /h)61218243036阳性转化子数P ositi ve tra nsf o r m a nts (n /103m L -1)15.0102.0310.0395.0452.0821.0无数产甘油假丝酵母细胞浓度Conce ntrat i o n of C.gl y cerino -genes cell (n /1093mL -1)2.5转化率(转化子/105产甘油假丝酵母细胞) T rasfor m at i o neffici ency (N o .o f tra nsf o r m a n t s /105C.g l yceri no g enes ce ll s)0.64.012.415.718.032.7无数:Num erous870 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 13卷在不同的根癌农杆菌浓度下产甘油假丝酵母的转化率见表2.相同酵母细胞浓度下500~1000倍的根癌农杆菌细胞浓度为最佳,当农杆菌的浓度再增大时转化率并无明显提高,浓度减小时转化率会降低.这与我们前期酿酒酵母转化研究中1B100的比例不同,可能是因为产甘油假丝酵母分裂增殖比较快,在产甘油假丝酵母细胞分裂前周围需要有更多的根癌农杆菌,增加他们的结合效率来提高T-DNA转入产甘油假丝酵母的几率.表2根癌农杆菌浓度对转化率的影响T ab l e2E ffect o f A.tu m efaciens ce lls p concentrationon transfor m ation e ffi c iency加入根癌农杆菌菌体量Am ounts of C.g l yce rinogenescell s added(V/L L)11050100200500阳性转化子个数Pos i ti ve transfor m an ts(n/103mL-1)536296352361343产甘油假丝酵母细胞数No.of C.g l yceri n o g enescell(n/109mL-1)1.51.62.02.21.71.8转化率(转化子/106产甘油假丝酵母细胞)Transfor m ati on effici enc y(No.oft rans for m a nts/106C.gl yc eri no ge nes cel ls)3.022.2147.2163208.7188.52.6转化子稳定性鉴定将转接了10代的转化子和原始菌株同在S M培养基(含Zeoc i n150mg/L)和Y PD培养基划线30e培养对照培养,在d1观察发现,转化子在两种培养基上均生长良好,原始菌株则无法在S M培养基上生长.提取染色体PCR验证,转化子依然可以扩增到zeoc i n特异条带.这些结果初步表明,产甘油假丝酵母阳性转化子特性可以稳定遗传.3讨论本研究通过将含有目的质粒pC AM3300-zeocin的根癌农杆菌LBA4404和产甘油假丝酵母共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,得到了阳性转化子菌株.根据zeo cin基因序列特异性设计引物,利用该引物进行了PCR验证,在产甘油假丝酵母染色体中无法扩增出目标产物,而在阳性转化子染色体中可以扩增得到目标产物,初步证明z eoci n基因已经成功地转入了产甘油假丝酵母染色体.表型验证结果也说明zeocin基因已经转入了产甘油假丝酵母.以上结果表明,已初步成功建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的方法.研究中还根据根癌农杆菌的生长特性,对转化诱导共培养时间以及酵母细胞和农杆菌细胞比例进行了优化,发现最佳共培养时间为24h,最佳细胞比例为1B500~1000,最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.根癌农杆菌转化系统具有操作简单(不需要制备原生质体)、转化效率高、易于得到转化子、转化子遗传稳定等优良的特点[12].本研究成功建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的方法,为开展相关产甘油假丝酵母的分子生物学研究,尤其是为将外源基因导入工业化产甘油假丝酵母进行表达提供了有力的工具.目前我们正在进一步采用根癌农杆菌转化法将酵母甘油合成的关键酶基因导入产甘油假丝酵母基因组中,相关结果将另文发表.R eferences1H i nn en A,H ic k s J B,F i nk GR.T rans f or m ati on of yeas t.Proc Na tlA c ad Sci U SA,1978,75(4):1929~19332Beggs J D.Transfor m ati on of yeast by a rep licating hybrid p l as m i d.N a-t ure,1978,275:104~1093L iM(李敏),N ie DS(聂东宋).C l on i ng and expression of a neu ro-tox i n p epti de gene f ro m Ch i nese b i rd s p i der(S ele nocos m i a huw e na)i n yeas t.Ch i n J Appl E nviron B iol(应用与环境生物学报),2006,12(5):651~6554Bundock P,Am keden DR,Be ij ersbergen AG M,H ooykaas PJ.T rans-k i ngdo m T-DNA trans f er fro m Agroba cte rium t um e fa cie n s to Saccharomy-c e s ce revisi a e.EM BO J,1995,14(3):3206~32145W ang ZX,Zhuge J,Fang HY,Prior BA.G l ycerol produ cti on by f er-m entation:A rev i e w.B i otec hnol Ad v,2001,19(33):201~2236Zhang J S(张君胜),Rao Z M(饶志明),W u L(吴蕾),Shen W(沈微),T ang X M(唐雪明),Fa m g HY(方慧英),Zhuge J(诸葛健).Research of Ag robacteri um t um efaciens-m ediat ed trans f or m ati on of S ac-c haram yc e s cerevisi a e.J F ood S ci&B i otec hnol(食品科技),2006,25(3):37~407Kuang XY(匡小婴),Rao Z M(饶志明),Shen W(沈微),Fa m g HY(方慧英),Zhuge J(诸葛健).S t ud ies on electroporation tran sf or-m ati on of Agrobac te rium t um e fa cie n s.J F ood S ci&B iot echnol(食品科技),2005,24(4):13~168Frank L W T,R i ngo W,C aro li ne B M,Petra MH,Art hu r FJ R,B en J CC.A on e-step m ethod to convert vectors i n t o b i nary vectors su i ted f or Ag robacteri um-m ed i ated transfor m ati on.Curr G e n et,2004,45:242~ 2489Shan S H(单世华),L i CJ(李春娟),Zhang J C(张君诚),Zhuang W J(庄伟建).M od ification and eval uation ofm ethod to extract p l as m i d DNA fro m A.t um e facie n s.B iot echnol ogy,2003,13(4):19~2010P iers KL,H eat h J D,L iang XY,S t eph ens KM,N ester E W.Ag robac-te rium t um e facie n s-m ed i ated tran sfor m ation of yeast.P roc Na tlA c ad S ci USA,1996,93:1613~161811Zhou XL(周小玲),Shen W(沈微),Rao Z M(饶志明),W ang ZX (王正祥),Zhuge J(诸葛健).A rap i d m et h od for p reparati on of fungal chro m oso m e DNA.M i crobiol ogy(微生物学通报),2004,31(4):89~9212L i u F(刘峰),Zhao YY(赵伊英),Su YC(苏永昌),Xu M(许明),Chen LN(陈丽娜),Zheng J G(郑金贵).Producti on of m arker-free tran s gen i c rice w i th pe p c gene by t w o Agroba cte rium-m ed i a-ted co-transfor m ation.Chin J Appl Env iron B iol(应用与环境生物学报),2005,11(4):393~3988716期饶志明等:根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化。