下载文档原格式
⾼效液相⾊谱法分析芳⾹类化合物⾼效液相⾊谱法分析芳⾹类化合物⼀、实验⽬的：1、了解⾼效液相⾊谱仪的基本结构、原理及操作。
2、了解⾊谱分离的基本原理，反相分配⾊谱的基本规律。
3、掌握⾊谱的基本定性、归⼀化法定量⽅法。
⼆、实验原理：以液体为流动相的⾊谱称为液相⾊谱，根据在两相分离过程的物理化学原理不同可分为吸附⾊谱、分配⾊谱、凝胶⾊谱、离⼦⾊谱、亲和⾊谱等。
本实验主要是分配⾊谱。
分配⾊谱即液液⾊谱，是基于样品分⼦在包覆于惰性载体上的固定相液体和流动相液体之间根据样品分配系数不同达到分配平衡。
反相分配⾊谱即流动相极性⽐固定相⼤。
反相分配⾊谱⽤的是⾮极性填料分析柱（如ODS-C18），流动相是极性较强溶液（如甲醇和⽔）。
⾊谱条件主要包括⾊谱柱、流动相组成与流速、⾊谱柱恒温箱温度，检测波长等。
芳⾹族化合物含有共轭双键，对220nm,254nm的紫外光有较强的吸收，可通过分配⾊谱分离检测，本实验采⽤反相HPLC检测。
三、实验仪器及试剂：实验仪器：Agilent 1100型液相⾊谱仪：真空在线脱⽓装置、四元梯度泵、多波长检测器。
ODS-C18柱试剂：甲醇（⾊谱纯），⽔（超纯⽔），苯、萘、菲的甲醇溶液，苯、萘、菲的混合液。
四、实验步骤：1、确定实验条件打开计算机，等启动完毕后依次打开输液泵、真空在线脱⽓装置、柱温箱、检测器开关。
（实验前已操作）通讯完毕后，设定操作条件。
流动相：甲醇/⽔=80/20；总流速0.500ml/min，设定在220nm，254nm两个波长进⾏检测30℃。
2、定性分析流动相⽐例设为甲醇/⽔=80/20，等基线平稳后依次将苯、萘、菲的甲醇溶液进样5µL，得出三种标准物质的保留时间。
将三种物质的混合溶液进样5µL同样实验条件下⽐较各峰的保留时间。
3、定量分析（⾯积归⼀化法）将上述混合液的定性谱图对应物质的3个峰⾯积积分校正因⼦校正后归⼀化计算（254nm）。
4、流动相组成对混合样保留时间的影响设定开始时流动相甲醇：⽔=80:20，平衡⾄基线稳定后开始进样，完成⼀次梯度洗脱后，⽤甲醇：⽔=80:20的流动相平衡约10min，开始第⼆次梯度洗脱。
液相色谱教程液相色谱定量分析原理液相色谱（Liquid Chromatography，LC）是一种广泛应用于各个科学领域的分析技术。
它是一种基于分子相互作用的分离技术，利用样品溶解在流动相中，在固定相上进行分离和分析。
液相色谱可以用于定性和定量分析，其中定量分析是液相色谱非常重要的应用之一液相色谱定量分析的原理主要基于分离物质的定量关系。
在液相色谱中，样品溶解在流动相中，与固定相发生相互作用，并在固定相上进行分离。
不同组分分离的速度和程度取决于它们与固定相之间的相互作用。
在定量分析中，通过测量特定组分在柱上的峰面积或峰高，可以得到该组分的浓度。
液相色谱定量分析的步骤包括：溶液的制备、样品的进样、色谱柱的选择、流动相的选择、检测器的选择和峰面积或峰高的测量。
首先，需要将待分析的样品溶解在适当的溶液中，以便进行液相色谱分析。
然后，样品被进样器进样到色谱柱中。
色谱柱的选择根据需要分离和分析的组分而确定，不同的色谱柱可以实现对不同组分的分离。
流动相的选择根据样品的特性和色谱柱的要求，需要考虑流动相的溶解度、挥发性、毒性等因素。
检测器的选择取决于分析的目的和需求，液相色谱中常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
最后，通过测量峰面积或峰高，可以根据已知的标准曲线或计算公式得到待测组分的浓度。
液相色谱定量分析的准确性和精确性可以通过一系列的方法来提高。
首先，样品的制备要准确和精确，避免样品中残留物和杂质的干扰。
其次，使用适当的内标物可以提高定量分析的准确性和精确性。
内标物是在样品中添加的标记物，与待测组分的性质相似，并且在色谱分析中能够产生特定的信号。
通过测量内标物和待测组分的信号比，可以减小样品制备和仪器操作的误差对定量结果的影响。
此外，还可以使用多点标定法、外标法、内标法等进行定量分析，以提高准确性和精确性。
总之，液相色谱定量分析是一种重要的分析技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
色谱的定量分析1.色谱分析有几种定量方法色谱分析常用的定量方法：归一化法、内标法和内加（增量）内标法、外标法。
1、面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。
但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。
2、外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液（或直接购买不同浓度标准溶液）分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。
在分析未知样时按与标准曲线相同的操作条件和方法，由标准曲线查出所需组分的浓度（现在在工作站上直接就能求出浓度）。
此法要求进样准确，操作条件稳定，分析样品和标准曲线条件必须一致。
3、内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。
内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。
内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是试样中不存在的纯物质，物质与被测物质相近，能溶于样品中，但不能于样品发生反应。
此法比较费事，一般不使用于快速分析。
2.常用的层析分析方法有哪些在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
分析检测高效液相色谱串联质谱法测定水果、蔬菜中双胍辛胺的定性定量分析研究尹丽丽（上海华测品标检测技术服务有限公司，上海 201112）摘 要：目的：建立水果和蔬菜中双胍辛胺的高效液相色谱串联质谱法的定性定量分析方法。
方法：样品经过正丁醇∶正己烷=1∶1混合溶液提取，再用酸化水净化。
以高效液相色谱质谱联用仪检测萃取液中的双胍辛胺的含量，采用HILIC-C18柱分离，在ESI正离子模式下，以质谱多反应监测，采用外标法进行定量分析。
结果：在10～500 ng·mL-1，双胍辛胺的线性良好，相关系数R＞0.995，检出限为0.002 0 mg·kg-1，定量限为0.011 mg·kg-1，双胍辛胺在3个浓度添加水平下，水果回收率在92.7%～108.9%，蔬菜回收率在96.2%～110.0%，水果相对标准偏差为1.15%～4.45%，蔬菜相对标准偏差为1.36%～2.15%。
结论：本研究建立的高效液相色谱串联质谱法测定双胍辛胺的方法准确、快速，能够满足水果、蔬菜中双胍辛胺的分析要求。
关键词：双胍辛胺；高效液相色谱串联质谱；水果；蔬菜Determination of Iminoctadine in Fruits and Vegetables by High Performance Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometryYIN Lili(Shanghai Huabiao Testing Technology Service Co., Ltd., Shanghai 201112, China) Abstract: Objective: A method was developed for the determination of iminoctadine of fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method: The sample was extracted with the solution of butyl alcohol and hexane (1∶1), and then cleaned-up by acidified water. Iminoctadine was determined by liquid chromatography mass spectrometer with a HILIC chromatographic column, analyzed in positive electronic spayionization (ESI+) mode with multiple reaction monitoring, and quantified by the external standart method. Result: The calibration curves were linear with the correlation coefficients over 0.995 in the range of 10～500 ng·mL-1 for iminoctadine. The limits of detection were 0.002 0 mg·kg-1. The limits of quantification were 0.011 mg·kg-1. The mean recoveries of iminoctadine at three spiked levels were in the range from 92.7% to 108.9% of fruits and 96.2%～110.0% of vegetables, with the relative standard deviations were in the range from 1.15%～4.45% of fruits and 1.36%～2.15% of vegetables. Conclusion: Determination of iminoctadine in fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established in this study which was accurate and rapid, suitable for analysis of iminoctadine in fruits and vegetables.Keywords: iminoctadine; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; fruits; vegetables双胍辛胺是一种广谱性杀真菌剂，对某些病原真菌有很高的生长抑制活性，其作用方式是抑制病菌类脂的生物合成，是触杀和预防性杀菌剂，对大多数由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果[1]。
高效液相色谱法测定萘乙酸的含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定萘乙酸的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理将已配制的浓度不同的萘乙酸标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R和峰高A后，可直接用t R定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定未知浓度萘乙酸的含量。
三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。
2、色谱柱：Zorbax C8，5µm，250×4.6mm，20μL定样环。
3、流动相：H2O和CH3OH4、萘乙酸标准溶液：精密称取萘乙酸标准品制成浓度(mg/L)分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2、5、8、10、15、20 mg/L的对照品溶液，放入冰箱备用。
5、未知物萘乙酸6、平头微量注射器。
四、实验步骤1、开机(1) 检查流动相、废液瓶和色谱柱；(2) 打开打印机和计算机的电源；(3) 自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符）；(4) 打开工作站。
2、编辑方法(1) 选择“Method”菜单，然后“EDIT METHOD”依屏幕提示进入以下设定：(a）泵对话框：设定泵的流速：1.0mL/min；H2O和CH3OH线性梯度洗脱：H2O 0 min：10%；1 min：20%；3 min：30%；4 min：30%；(b）检测器对话框：设定波长337 nm。
(2) 单击“Method”菜单，选中“Save Method As…”，输入方法名，单击OK。
(3) 从“Run Control”菜单中选择“Sample Info…”选项，输入操作者名称，在“Data file”中选择“Manual”或“Prefix”。
(4) 单击Ok，等仪器Ready，基线平稳。
液相色谱仪最小检测浓度和定量测量重复性的测量不确定度1 测量方法（依据JJG 705--2002）液相色谱仪依据国家计量检定规程JJG705—2002《液相色谱仪》进行检定，其中紫外-可见光检测器、二极管阵列检测器均需测量最小检测浓度，整机还需检定定性测量重复性及定量测量重复性。
紫外-可见光检测器和二极管阵列检测器浓度的测量方法：选用18C 色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0mL/min ，紫外检测器的波长选在254nm ，检测灵敏度调在最灵敏档，记录纸速调至5—10cm/min （使用工作站的设置好相关参数）。
开机预热，待仪器稳定后记录30min ，由检测器的衰减倍数和测得的基线峰—峰高对应的记录仪标度，按公式d N =KB 计算基线噪声。
保持操作条件，用微量注射器从进样口注入10～20uL 1×10/g mL -7的萘/甲醇溶液，打印的色谱图及相关数据或记录色谱图并测量计算相关数据，由色谱峰高和基线噪声峰—峰高，计算最小检测浓度L c (按20μL 进样量计算)。
整机定性、定量重复性的测量方法：将仪器各部分连接好，选用18C 色谱柱，根据仪器配置的检测器，选择流动相和测量参数：紫外检测器和二极管阵列检测器用100%甲醇为流动相，流量为1.0mL/min,,检测波长为254nm ，灵敏度选择在0.04左右，基线稳定后由进样器注入5--10μL 的4110/g mL -×萘/甲醇标准溶液；连续测量6次，记录色谱峰的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差6RSD 。
2 数学模型 2.1 最小检测浓度 2=20d L N cVc H（1） 2.2 定性、定量重复性6=RSD 1X%×100 3 方差和灵敏系数方差 222222222u ()=()()()()u ()()+()()c L d d C c N u N c c u c H u H c V u V （3）灵敏系数 d ()2/(20)C N cV H = ()=2/(20)d C c N V H （9） 4 最小检测浓度的不确定度分析与计算4.1 标准不确定度分量的分析和计算4.1.1 输入量标准溶液浓度定值c 的标准不确定度u(c)的分析和计算输入量c 的标准不确定度u(c)主要来源于标准溶液浓度定值的标准不确定度，采用B 类评定方法进行评定。
定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。
液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。
液相色谱法定量的依据
被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。
定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。
由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。
测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。
定量分析常用术语：
样品（sample）：含有带测物，供色谱分析的溶液。
分为标样和未知样。
标样（standard）：浓度已知的纯品。
未知样（unknow）：浓度待测的混合物。
样品量（sample weight）：待测样品的原始称样量。
稀释度（dilution）：未知样的稀释倍数。
组分（componance）：欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。
组分的量（amount）：被测物质的含量（或浓度）。
积分（integerity）：由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。
校正曲线（calibration curve）：组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。
常用的定量方法
1
外标法
标准曲线法，分为外标法和内标法。
外标法在液相色谱中用的最多。
内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。
用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。
注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。
在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
在完全相同的实验条件下，注入未知样品，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。
外标法的优点：
操作、计算简单，是一种常用的定量方法；无需各组分都被检出、洗脱；需要标样；标样及未知样品的测定条件要一致；进样体积要准确。
外标法缺点：
实验条件要求高，如检测器的灵敏度，流速、流动相组成的不能发生变化；每次进样体积要有好的重复性。
2
内标法
操作：
将已知量的内标样加入标准样品，制成混合标样，并配制一系列的已知浓度的工作标样。
混合标样中标样与内标样的摩尔比不变。
注入色谱柱，以（标样峰面积/内标样峰面积）为响应值。
根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
将已知量的内标样加入未知样品，注入色谱柱，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。
内标法的特点：
操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。
内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。
案例分析
案例分析一
我做的是苯酚羟基化反应，产物中有苯酚，苯二酚（邻，对），苯醌，焦油，用安捷伦1100液相色谱分析，外标法计算选择性和转化率。
但一直以来，计算出的结果老是差强人意。
偶尔算出一个好的结果，但是一重复又不行了，有时候重复做几次都不一样，很是郁闷。
最近又老算出来选择性超过100%。
开始怀疑稀释误差的问题（样品是稀释以后去测的)，但现在操作的时候非常小心了，怀疑标准曲线的问题，但是重新做了好几条了。
结果就是很奇怪，自己想了想：
1.因为液相色谱仪是公用的，所以特意买了专用的色谱柱。
但经常测的时候发现柱压不一样，是不是因为这个影响了峰面积，进而影响了结果？柱压的影响这么大么？
2.是不是外标法就不准确？该用单点校正法？之前觉得每次测样前都配一个标样有点麻烦，所以没用。
3.还是别的什么原因？
补充：用的柱子是ZORBAX SB-C18, 用的甲醇：水=3：7，每个峰都分的很开。
取样后离心去掉催化剂，再定量稀释然后去测的。
网友七嘴八舌：
- 有时候确实柱压不同会对结果有影响，但这是柱压差别很大的情况才会发生。
是不是柱子没冲洗好，或者需要看是否进气泡了，因为这都可能导致结果不准。
- 如果柱压的差别很大的话，比如30bar已经很大了，平时用的时候，有柱温箱，一般都控制温度恒定的，基本同意条件不会有这么大的变化，最多10bar上下浮动，通常小于5bar。
- 是不是走过缓冲盐的流动相？用水低流速长时间冲洗，再换乙腈冲洗试试看。
是不是有些不物残留在柱子中没有及时冲洗导致柱压偏高，可以尝试用异丙醇试试。
- 柱压变化主要会影响保留时间，对峰面积影响不大。
你所说的重复性不好，是液相进同一个样品重复不好还是不同的样品。
如果不同的样品那是你反应的问题。
至于选择性超过100%？是否是计算方法错误？
- 简单来说，计算苯二酚的选择性：
假设对苯峰面积代入标准曲线得浓度C1(g/ml)；邻苯峰面积对应浓度C2，苯酚峰面积对应浓度C，溶液总体积V，稀释倍数20，初始苯酚加入量m(g),如下
- 计算公式如果没错，可以看看是否自己没有做过空白以及反应投料时的组分测试。
- 至于单点还是外标法？
单点校正比较简单，如果要求不是很严格的话，单点校正可以满足要求。
单点标准浓度如果在被测样品浓度附近，结果比外标法更准确。
做考核样时，我们一般先用外标法定出大致浓度范围，再以单点法定量。
单点一般适用于线性曲线截距在100%浓度点2%以下的。
高于20%不能采用单点校正和外标。
外标法对照和拱式样品浓度应一致，校正曲线线性符合即可。
案例分析二
我想用液相色谱进行定量分析，使用外标法。
问题是：标准曲线是不是每次测定样品时都要做一次？我有200个样品，但不是一次能做好，每次我可以测20个样品。
难道我每次测定前都要先做一下标准曲线？我是同一台仪器，同一条件。
网友七嘴八舌：
从严格意义上来讲应该是每天做一条标准曲线。
如果你做的东西要求不是太严格（不需要报批），可以考虑隔几天做一天标曲。
不可否认的是，每天都做标准曲线能减小测量的数据的误差。
但是如果是药品检测，是应该每次开机测定样品前做一条标准曲线或单点校正标准溶液分析，但普通化工分析要求不严就没有必要每次做曲线，因为差异不大的。
但如果是检测单位检测样品，就要根据标准来执行了。
说白了其实是规范不规范的问题。
