高效液相色谱仪器分析实验教案

高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。

二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。

色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。

⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。

特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。

b内标法。

特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。

c 标准曲线法（外标法）。

简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。

d 内标标准曲线法。

三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。

2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。

排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。

高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习《基础分析化学实验（第二版）》137－140页。

【目的】(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理；(2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。

【原理】高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。

它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。

色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。

而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。

评价色谱柱的性能参数主要有：（1）柱效（理论塔板数）n式中t r 为测试物的保留时间，W 1/2为色谱峰的半峰宽。

（2）容量因子k’式中t 0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。

(3) 相对保留值（选择因子）α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。

(4) 分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间，W b1、W b2分别为两峰的底宽。

对于高斯峰来讲，W b =1.70W 1/2。

为达到好的分离，我们希望n 、α和R s 值尽可能大。

一般的分离（如α=1.2，R s =1.5），需n 达到2000。

柱压一般为104 kPa 或更小一些。

本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。

【仪器和试剂】Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i 进样器，440检测器和记录仪组成）色谱柱：5 cm ×4.6 mm I.D., YWG-C 18H 37 (ODS)，10 μm流动相：甲醇－水(80+20)样品I ： 含尿嘧啶 (0.010 mg ·mL －1)、萘 (0.010 mg ·mL －1)、联苯 (0.010 mg ·mL －1)、菲（0.006 mg ·mL －1）的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。

实验1气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定一、目的要求1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。

4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。

二、基本原理气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。

由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。

对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。

而其中气相色谱分离条件的选择至为关键。

主要涉及以下几个方面：1.载气对柱效的影响：载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数D m(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的D m(g)。

根据速率方程：（1）涡流扩散项与载气流速无关；（2）当载气流速u小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数D m(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；（3）当载气流速u较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。

2.载气流速（u）对柱效的影响：从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。

对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u图。

由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。

药学生物技术本科仪器分析学实验教案一、实验课程名称：高效液相色谱法测定药物含量1. 实验目的：（1）掌握高效液相色谱（HPLC）的基本操作步骤。

（2）学会使用高效液相色谱仪进行药物含量测定。

（3）理解高效液相色谱法的原理及其在药物分析中的应用。

2. 实验原理：高效液相色谱法（HPLC）是一种利用高压将液体流动相泵入装有固定相的色谱柱，根据药物分子与固定相之间的相互作用力的差异，实现药物的分离和测定。

3. 实验步骤：（1）准备高效液相色谱仪，并检查仪器是否正常工作。

（2）准备对照品溶液和供试品溶液。

（3）设定色谱条件，包括流动相组成、流速、柱温等。

（4）进样并启动仪器，记录色谱图。

（5）计算药物含量。

二、实验课程名称：紫外-可见光谱法测定药物浓度1. 实验目的：（1）掌握紫外-可见光谱法的基本操作步骤。

（2）学会使用紫外-可见分光光度计进行药物浓度测定。

（3）理解紫外-可见光谱法的原理及其在药物分析中的应用。

2. 实验原理：紫外-可见光谱法（UV-Vis Spectroscopy）是利用药物分子对紫外或可见光的吸收特性，通过测定吸光度与药物浓度之间的关系，实现药物浓度的测定。

3. 实验步骤：（1）准备紫外-可见分光光度计，并检查仪器是否正常工作。

（2）准备对照品溶液和供试品溶液。

（3）测定空白溶剂的吸光度。

（4）测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度。

（5）根据吸光度与浓度之间的关系，计算药物浓度。

三、实验课程名称：原子吸收光谱法测定金属元素含量1. 实验目的：（1）掌握原子吸收光谱法（AAS）的基本操作步骤。

（2）学会使用原子吸收光谱仪进行金属元素含量测定。

（3）理解原子吸收光谱法的原理及其在药物分析中的应用。

2. 实验原理：原子吸收光谱法（AAS）是利用特定元素的原子在光源的照射下，从基态跃迁到激发态，再回到基态时发出特定波长的光，通过测定该光的强度与元素浓度之间的关系，实现金属元素含量的测定。

3. 实验步骤：（1）准备原子吸收光谱仪，并检查仪器是否正常工作。

高效液相色谱-- 仪器分析实验教案仪器分析实验课程教案实验名称: 高效液相色谱混合物的定量和定性测定验证性实验类型教学时数7 每组人数8 一、实验目的及要求:1(掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法2( 了解高效液相色谱的构造、原理;3( 学习高效液相色谱仪的操作。

教学重点:1、溶液配制的条件2、色谱工作站参数的设定。

3、定量定性分析方法教学难点:(1) 、学习高效液相色谱的使用方法、了解该仪器的结构(2) 、定量定性分析方法、实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、主要仪器和试剂主要仪器：安捷伦1260液相色谱仪，配有紫外检测器，Phenomenex OD®];自动进样器。

试剂: 色谱纯甲苯、苯、丙酮、甲醇、超纯水;未知样品1、2、3、4。

教学内容及过程（一）检查实验预习报告（二）上次实验存在的问题（三）高效液相色谱操作（四）实验内容及步骤A、溶液配制1 配制标准系列溶液三组分混标液：每mL溶液分别含5 uL苯、甲苯和丙酮。

分别准确移取0、2.50、5.00、10.00和20.00 uL甲苯容易溶于I.OOmL甲醇中。

2 流动相的配制、过滤和除气。

标准苯测试液。

未知样品1 号、2 号、3 号和4 号。

B 、上机测定1 更换流动相。

2 按操作规定开动仪器，排气后让色谱柱平衡（流动性为80%甲醇，速度1.0 mL/min）。

3 设置色谱工作站参数。

Agilent HPLC 仪色谱柱：流动相：甲醇：水=8：2流速:1.0 mL/min检测波长:254nm进样体积:10卩L4 进样、采集色谱图。

仪器分析检测技术电子教案发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。

2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。

反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。

正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。

采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。

液相色谱分析法模块之任务4外标法定量教学任务□讲解样品处理方法□叶酸片中主成分的含量测定□应用外标法进行定量分析□讲解分析中的污染和仪器的维护教学方法□引探与讲练结合教学学时□每20人一个学习组，4人一台液相色谱仪，分组循环操作，整个任务需6学时。

教学设计问题：叶酸片中叶酸含量的测定方法？I汇总所查资料♦,师’共同讨论，教师总结并讲解样品处理方法教师展示测定叶酸j量测定的过程，尤其是样品处理过程学生对此过程中不!!解之处进行提问学生完成叶酸片中叶酸含量的测定操作I学生练习外标法定量，解决实例，评价药品质量I学生讨论，教师引导分析I问题：分析中的污染有哪些？教师讲解高效液相色谱仪的维护I下次课程问题：液相色谱是如何实现混合物的分离？课程引入□问题：叶酸是作为人体必须的营养成份之一，如何测定叶酸片中叶酸的含量？（上次课结束后即布置并安排学生在课后查阅资料）□学生根据所查资料提出解决方案并进行现场讨论以决定各解决方案的优劣。

（教师可事先准备几种办法以备用，如化学分析法、液相色谱法（内标法、外标法）等。

）□最后教师引出本次课程的教学内容：“采用外标法测定叶酸的含量”□药物作为一个复杂的混合物，如何对混合物进行前处理？样品处理（教师可引导学生回忆在以前实训中样品的预处理方法）样品前处理是指样品的制备和对样品中待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。

前处理的目的是消除基质干扰，保护仪器，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。

样品处理是分析检测的美键环节时间，约占分析检测时间的60%。

□提取提取就是用物理的或化学的手段破坏待测组分与样品成分间的结合力，将待测组分从样品中释放出来并转移到易于分析的溶液状态，提取过程可以除去99%以上的样品基质。

经典的方法有均质提取法、振荡提取法、索氏提取法等。

□净化提取过程中，许多与待测组分溶解性相似的杂质将被•起转移出来，这些杂质会干扰对待侧组分的测定，因此需要将待测组分与杂质分离，这个分离过程称为净化。