高效液相色谱定性定量分析的方法53页PPT

①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈

• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。

色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统

此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。
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流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
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色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
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四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。

效能指标：评价分析方法的尺度
效能指标包括: 精密度、准确度、专属性、检测限、定量限、
线性与范围、耐用性、稳定性、系统适用性等
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不同分析测定方法的要求
药品质量标准分析方法验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验
指导原则 药物稳定性试验指导原则 缓释、控释制剂指导原则
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②准确度（accuracy）：
意义：测量值与真实值接近的程度。
药物制剂的含量测定以回收率表示。
内容：即通过在空白基质中加入已知量不同浓度的对照
品，比较测定值和加入值确定。 一般在期望浓度的80%、100%、120%三个
水平量，各测定三次，回收率均值在98-102%。
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③线性范围（linearity range）：
内容：
流动相的组成和pH、商品柱的品牌尺寸、 柱温等
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⑧系统适用性（ system suitability test ）： 意义： 保证分析系统适用于定量分析。
内容：
条件优化时考察，包括理论塔板数、分离 度、拖尾因子，考察进样精密度。
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三、不同检测器的色谱信号与物质浓度关系
FID、ECD、UV检测器的响应（峰面积）与样 品的浓度呈线性关系；
ELSD响应的自然对数与样品的浓度或质量呈线 性关系；
质谱（MS-ESI）检测器高浓度时的响应与样品 的质量可能呈二次或更复杂的方式。
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四、色谱分析方法验证
目的：
证明所采用的色谱分析方法适合于相应的检验 要求，判断能否用于药品分析。
China Pharmaceutical University

四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。

分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；

§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法

注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域

liquid-solid adsorption chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next