【资源】自己整理的慢病毒质粒的知识

质粒 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。

现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。

但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。

这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。

没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。

实验小站慢病毒系列（三）——慢病毒常见问题汇总实验小站慢病毒系列（三）慢病毒常见问题汇总◆ ◆ ◆◆常用术语病毒感染复数（MOI）：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。

其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。

噬菌体的数量单位为pfu。

一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。

后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，以下提到的MOI都是沿用这个概念。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。

能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。

MOI=病毒滴度×体积/细胞数量病毒的滴度（BT）：指单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。

滴度是一个病毒自身复制的数量概念，有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度，1）VP(病毒颗粒)或OPV（光学颗粒单位）2）GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3）PFU（空斑形成单位）4）TCID50（50%组织培养感染剂量）慢病毒技术中，病毒颗粒滴度（BT=TU/ml，transducing units）计算公式：TU/μl=(P×N/100×V)×1/DF，P=%GFP cells，N=转染时的细胞数，V=每孔加入病毒稀释液体积（μl），DF=稀释因子（dilution factor）=1（undiluted)、101（diluted 1/10）、102（diluted 1/100）常用慢病毒滴度检测方法常见问题解答Q.目前存在许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，针对我的实验应该使用哪个系统?腺病毒：针对大多数细胞有几乎100%的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，不整合到宿主细胞。

稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》）（大肠杆菌-８0℃保存2-3年,质粒-２0℃保存2—3年,病毒液—80℃保存１年)(１)载体质粒:两端得LＴR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于env序列中得RRＥ,含宿主RNＡ聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）:包含了pｏl、gａｇ包装成分（３）包膜质粒（pＭD2、G):用其她病毒得包膜蛋白代替了ｅnv基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。

2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTＲEME—ＧENＥ(－20℃保存，不可分装），一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存)：5ＸPＥG800０／NaＣｌ溶液(聚乙二醇)：NaCl ８、766 g; PEG８00050ｇ溶解在2０0mｌMilｌi-Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存３天）:滴度一般为10８TU/ml6、10ｍｇ/ml polyｂreｎｅ（-20℃分装保存）:溴化己二甲铵。

就是带正电得小分子，与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏｌybrｅnｅ能提高感染效率２～1０倍。

有一定细胞毒性，需要摸索浓度(1～１0μｇ/ｍl）7、无血清培养基:ｏｐtｉmｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、puromｙcin:嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤＜一〉病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,10×1０５个293Ｔ细胞，加入全培养基双抗ＤMＥM４—5ml，过夜2、配制5ＸPＥG８0０0/NaCl溶液称取NaCｌ8、766 g； PEG800０ 50g溶解在200ml Miｌli-Ｑ纯水中;1２1摄氏度３０miｎ湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天１、配管2、加入２ml全培养基DMEM3、将1加入2,孵育10ｈ，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00与1７：0０各收取一次5ｍｌ培养液,共20mｌ（－80℃保存)2、过滤:用孔径为０、４5mm得过滤器除去上清中得29３T细胞3、加入5ml 5ＸPEＧ８０0０/NaＣｌ溶液,每30miｎ－1ｈ上下摇匀一次4、４℃过夜第六天１、4℃,3500rｐｍ，20ｍiｎ２、弃上清,倒扣纸上静置1－2min，吸干残余液体３、加入120—１50μlＰBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶４、５0μｌ分装，—80℃保存。

质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。

现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。

根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。

一般分子量较大的质粒属严紧型。

分子量较小的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。

如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。

但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。

这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。

没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。

慢病毒质粒常见问题汇总
Q1：逆转录病毒和慢病毒是一回事吗？可以用逆转录病毒包装质粒包装慢病毒吗？A1：慢病毒是逆转录病毒家族的一部分，通常称之为“逆转录病毒”的是逆转录病毒家族的另一个独立成员——g-逆转录病毒。

尽管慢病毒和g逆转录病毒使用相同的基因进行包装（即gag、pol和env），但这些蛋白质的亚型以及病毒的长末端重复序列（LTRs）是不同的。

慢病毒和逆转录病毒包装载体不能互换。

虽然差异看起来很微小，但决定了慢病毒和逆转录病毒之间的关键生理差异。

慢病毒能够进入一个完整的核膜，能感染分裂细胞和非分裂细胞，而逆转录病毒只能感染分裂细胞。

在选择合适的基因递送系统时，需要考虑特定的靶细胞或组织。

Q2：可以使用慢病毒转移载体进行瞬时转染吗？A2：技术上可以。

但是否真的有效，需要看情况。

大多数转移质粒使用弱病毒LTR启动子来驱动目的基因的表达。

因此，蛋白质表达水平往往比使用专门为瞬时表达设计的质粒载体或病毒转导时要低得多。

虽然不理想，但病毒结构的瞬时表达是一个有用的工具，它可以在投入大量时间和资源构建稳定的细胞系之前快速检查结构是否正常。

当瞬时表达病毒结构时，需要使用合适的细胞系。

一些常见的实验室细胞系，包括293细胞系，用腺病毒蛋白E1A永生化，该蛋白已被证明能抑制HIV-1 LTR 的表达。

稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。

2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。

是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。

有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。

慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。

因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。

为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。

慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。

慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。

不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。

以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。

准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。

慢病毒包装总结慢病毒的成分现在的慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分，这样做的目的就是为了增加安全性，毕竟如果只用一个成分的话，危险系数很高，人一旦接触这种病毒就有可能遇到危险。

而把这几个成分分散在几个质粒中，很难在体外形成危险的病毒颗粒。

第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，第3代慢病毒包装系统含有4个质粒。

这两代病毒包装系统都含有以下相同的成分：第一，编码目的蛋白或转录目的基因的转移质粒。

其实就是你自己的目的质粒，也就是通常需要自己做载体的质粒。

目的基因的两侧都含有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat），LTR的作用就是辅助目的基因插入到宿主细胞的基因组。

许多慢病毒质粒都是基于HIV-1病毒改造的。

为了安全目的，这些目的质粒的复能能力并不完全，它们的3'LTR有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating）（SIN）。

第二，包装质粒，毒包装的结构蛋白编码质粒。

第三，包膜质粒，编码蛋白质外壳。

第二代慢病毒利用病毒的LTR启动子用于基因的表达，第三代慢病毒利用一个杂合的LTR启动子进行基因表达。

第二代慢病毒下图是第二代慢病毒系统：这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。

第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。

第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件的来激活它。

所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。

第三代慢病毒第3代慢病毒如下所示：设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。

在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。

一些搞不懂的生物学常识51.pcDNA3.1-VSVg与pCMV4.3-Luc.R-E这两个质粒共转染293t细胞能包装出假病毒吗？pcDNA3.1-VSVg是编码病毒衣壳蛋白VSV-G的质粒，pCMV4.3-Luc.R-E是编码荧光素酶基因的质粒，其表达需要辅助质粒pCMV4.3-RSV-Rev。

将这两个质粒共转染293t细胞，可以包装出VSV-G假病毒（VSV-G pseudovirus），但需要同时包含pCMV4.3-RSV-Rev才能实现荧光素酶的表达。

VSV-G假病毒可以用于基因传递、细胞入侵等研究领域，但需要注意的是，它并非真正的病毒，而是一种类似于病毒的颗粒。

因此，在使用VSV-G假病毒时，需要采取相应的安全措施，以免对实验人员和环境造成风险。

2.这个辅助质粒pCMV4.3-RSV-Rev的作用是什么？pCMV4.3-RSV-Rev是一种辅助质粒，它的作用是提高pCMV4.3-Luc.R-E质粒表达荧光素酶基因的效率。

pCMV4.3-Luc.R-E质粒包含荧光素酶基因和其启动子，但该启动子的活性在哺乳动物细胞中较低。

pCMV4.3-RSV-Rev质粒则含有反转录病毒RSV的Rev基因，可以增强pCMV4.3-Luc.R-E质粒中的启动子活性。

在同时包含pCMV4.3-RSV-Rev和pcDNA3.1-VSVg的情况下，细胞可表达荧光素酶基因并包装出能表达该基因的VSV-G假病毒颗粒。

因此，pCMV4.3-RSV-Rev的作用是增强pCMV4.3-Luc.R-E质粒表达荧光素酶基因的能力，从而促进VSV-G假病毒的制备。

3.双质粒系统慢病毒质粒名称分别叫什么名字？双质粒系统慢病毒通常采用第一代或第二代质粒系统，其中包括两个质粒：载体质粒和包装质粒。

载体质粒通常是一种携带外源基因序列的质粒，它可以用于整合到宿主细胞基因组中。

常见的载体质粒包括pLenti、pRRL和pLV等。

包装质粒则包含了病毒的基因组和其所需的辅助基因，它可以通过转染到携带载体质粒的细胞中，从而将外源基因整合到宿主细胞基因组中。