逆转录病毒载体

细胞工程逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。

因此，动物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。

病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。

常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。

逆转录病毒载体的构建包装细胞重组逆转录病毒感染早期胚胎一、技术要点2.收集细胞3.病毒转导靶细胞4.目的基因整合并表达1.携带目的基因转移载体与包装载体共转染包装细胞 包装细胞 靶细胞联合显微注射技术，将克隆有外源目的基因的逆转录病毒载体注射入处于减数分裂中期Ⅱ的卵母细胞，培育转基因动物。

通过逆转录病毒载体获得基因小鼠♀ 8细胞胚 联合小鼠纯合转基因小鼠杂交、筛选植入代孕小鼠二、逆转录病毒感染法优缺点1.优点◆逆转录病毒可直接感染胚胎，把外源DNA引入细胞，且转移效率很高。

◆逆转录病毒载体DNA没有合成病毒蛋白的能力，所以被转化的宿主细胞不会再产生有害的病毒颗粒，在安全的情况下，能够合成目的基因的产物。

◆利用逆转录病毒作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因的转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。

2.缺点◆低拷贝数◆需要逆转录病毒◆插入DNA大小有限◆可能产生不希望的重组◆逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达思考题1. 逆转录病毒感染法的技术要点是什么？2. 逆转录病毒感染法联合显微注射技术如何培育转基因动物？3. 逆转录病毒感染法有什么优缺点？。

墨鎏堕登奎兰苎主堕塞兰兰垡鲨苎Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｏｌｓｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｇｅｎｅｓｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓ）ｖｅｃｔｏｒｓｐｅｒｍｉｔｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｔｏｂｅｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｖｅｃｔｏｒ，ａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ－ｂｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｎｕｐｓｔｒｅａｍｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｔｗｏｏｒｍｏｒｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡ．ＴｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｏｎｅＩＲＥＳ，ａｎｄｇｅｎｅｉｓｃａｐ·ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ａｎｄｏｔｈｅｒｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅａｖｏｉｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩＲＥＳｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｓｍａｌｌｅｒｇｅｎｏｍｅ，ｈｉｇｈｅｒｖｉｒａｌｔｉｌｅｒａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｕｄｙ，ｔｗｏＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ—ｐｂＧＨｌｍｄｒａｎｄｐｈＧＭ－ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩｎｔｈｉｓＣＳＦＩｔｋｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｍｄｒｌｇｅｎｅｏｒｔｈｅＨＳＶ－ｔｋｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｓ．ＴｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｂＧＨａｎｄｈＧＭ－ＣＳＥＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｅｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｉｎｖＮｏｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＰａｒｔｈＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｌａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳＯｂｊｅｃｔ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｔｏＣＯ—ｅｘｐｒｅｓｓｄｒｕｇ．ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｍｄｒｌｇｅｎｅｗｉｔｈｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ（ｂＧＨ）ｇｅｎｅｉｎｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅＮＩＨ３Ｔ３ａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏ７基因转移到哺乳动物细胞的实验研究，为人类基因治疗提供了先导技术，通过将有意义的外源性基因转移并整合到体内特异细胞的染色体内，用于治疗某些严重感染疾病、遗传病及体细胞基因病（如癌症、家族性心脏病和爱滋病等）的基因治疗将成为２１世纪治疗学的最新手段‘。

逆转录病毒包装系统时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧作者：51atgc点击：1488次一、逆转录病毒概述反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。

逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。

逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。

二、逆转录病毒的许多特点便于其发展成为动物基因克隆载体。

①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。

这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。

②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。

逆转录病毒载体最大优点是(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2) 转入的外源基因可完全整合(3) 对细胞感染率高，达到100 %(4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因三、逆转录病毒载体的包装原理逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。

在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。

当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。

逆转录病毒载体2019版高中生物学选择性必修三说，通常是利用质粒作为载体（vector），将基因送入细胞：基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

载体（Vector）作用，一是用它作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞中去；二是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。

最终在受体细胞中表达大量目的基因产物，经分离纯化被人们利用。

作为载体必须具有四个条件：①在受体细胞中能保存下来并能大量复制；②有一个至多个限制酶切点，而且每种酶切位点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于进行筛选。

如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。

④对受体细胞无害。

一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。

现今实际所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。

常用的载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核区DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。

质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。

另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。

除以上两类外，人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。

原因是它们有双链DNA分子，可以与目的基因进行连接。

而目前基因工程中常以逆转录病毒作为载体，其优点是逆转录病毒作为载体时可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA的复制而复制，并进行表达。

逆转录病毒载体介导DNA转染关键词：逆转录病毒载体DNA转染2012-10-09 00:00 来源：丁香园点击次数：164逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。

此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。

介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。

首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。

如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。

反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：①反转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；③外源基因整合的拷贝数一般只有一个；④反转录病毒只选择感染分裂细胞；⑤病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。

反转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。

(一)可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立1、逆转录病毒载体进入包装细胞系从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。

逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。

在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA，再通过DNA复制、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。

逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。

逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、基因治疗、生物制药等得到广泛的应用。

逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以感染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等；转入的外源基因可完全整合；对细胞感染率高；感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。

逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。

在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。

当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。

宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。

服务内容
将目的基因片段克隆到逆转录病毒载体上；逆转录病毒的包装、扩增、滴度的测定。

客户提供
样品；目的基因信息或者序列。

我们提供
含有目的基因片段的逆转录病毒；所用的引物序列、测序结果；详尽完整的实验报告。

逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定摘要：为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能，构建了C端带有FLAG、HA、6xHis三标签的pOZ-KLF5真核表达逆转录病毒栽体。

pOZ-KLF5栽体可通过一次转录得到双顺反子转录单位，即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质：三标签融合蛋白KLF5-3xTag和筛选标记——白细胞介素-2受体a （IL-2Ra）。

通过偶联IL-2Ra抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3xTag表达阳性的293T细胞，经Western-blot检测细胞内KLF5-3xTag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响，发现KLF5-3xTag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多，且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解，与已有报道一致。

进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。

该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。

关键词：KLF5；双顺反子转录；真核表达；三标签融合蛋白中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu，WANG Wei-xi，LU Ze-lan，HUANG Lei，ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）Abstract：To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5，the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5，with the FLAG，HA，6xHis triple tags at C-terminal，was con?structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins：triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody，and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then，the proliferation and cell cycle of 293T were tested，and the results indicated that KLF5-3xTag promotes the proliferation of cell colonies and the Gl/S transition.In addition，co-expression of WWP1，a known E3 ligase of KLF5，can decrease KLF5-3xTag protein level，which is consistent with previous reports. Furthermore，immunoprecipi- tation experiment was applied to prove the immunoreaction of the tags. The successful construction of pOZ- KLF5 provides a powerful tool to study the interacting proteins of KLF5 and to explore the biological func?tions of KLF5.Key words：KLF5；bicistronic transcription；eukaryotic expression；triple-tagged fusion protein（Life Science Research，2015，19（2）：124?130）KLF5蛋白是类KtlippeKKriippel-likefactors，KLF）转录因子家族的一员，属于基础转录因子。

逆转录病毒载体逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。

此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。

介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。

保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。

[首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。

如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol 和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。

反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：①反转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；③外源基因整合的拷贝数一般只有一个；④反转录病毒只选择感染分裂细胞；⑤病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。

反转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。

优点：（1）逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性；（2）包装好的假病毒颗粒易于分离制备；（3）逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞；（4）前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。