人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。

方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。

结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。

结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。

【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定HIF1α是一种重要的响应细胞缺氧的转录因子，参与了一系列细胞代谢和生存过程的调控。

因此，研究HIF1α的表达调控机制对于深入理解细胞生物学过程具有重要意义。

RNA干扰技术是一种有效的基因沉默方法，通过转染表达特定的shRNA序列可以降低目标基因的表达水平。

在本实验中，我们通过克隆HIF1α-shRNA序列到载体中，在细胞水平上验证其对HIF1α的抑制效果，为后续研究提供基础保证。

1. 载体构建我们选择pGPU6/GFP/Neo载体作为表达载体，该载体具有绿色荧光标记并带有慢病毒包装序列，适合于在细胞中稳定表达。

我们在载体中插入了针对HIF1α编码序列的shRNA 序列，并在该序列的末端添加了环状病毒MluI启动子和miR30e终止子。

所选shRNA序列如下：5'-GGTCCTGTGCTTCAACTAT-3'2. 载体鉴定为验证所构建的载体是否能在细胞中稳定表达HIF1α-shRNA，我们进行了荧光定量PCR检测和Western Blot分析。

2.1 荧光定量PCR检测我们在293T细胞中转染了HIF1α-shRNA载体和对照载体（不含shRNA序列）后，提取总RNA并进行反转录。

然后，利用荧光定量PCR技术检测HIF1α mRNA表达水平的变化。

结果显示，HIF1α-shRNA载体转染组的HIF1α mRNA表达水平较对照组显著降低，表明HIF1α-shRNA能有效沉默目标基因的表达（图1）。

2.2 Western Blot分析综上所述，我们成功构建了HIF1α-shRNA表达载体，并证实了该载体在细胞水平上能够有效降低H IF1α表达水平。

该表达载体可为研究细胞代谢和生存过程提供重要的工具和支持。

S c ie nc e &T e c hno lo g y V is io n 缺氧诱导因子-1（hypoxia -inducible factor -1,HIF -1）最初是从缺氧诱导的肝癌细胞Hep3B 的细胞核中发现的一个转录因子，由氧敏感的α亚基（HIF -1α）和持续稳定表达的β亚基（HIF -1β）以异源二聚体的形式组成，HIF -1α是调节亚单位，决定HIF -1的活性，HIF -1β则与稳定HIF -1及其二聚化有关[1]。

已经证实，HIF -1可介导肿瘤细胞产生一系列的缺氧适应反应，与肿瘤细胞的糖酵解途径密切相关，使肿瘤细胞在相对缺氧的状态下获得更多的能量供应，以维持存活、生长和分裂[2]。

本研究将构建HIF1α-shRNA 表达载体，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用提供生物学基础。

1材料和方法1.1材料表达载体pG1.1（武汉巴菲尔），限制性内切酶BsaI 、SacI （美国NEB ），T4DNA 连接酶、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞DH5α（北京天根），DNA 寡核苷酸由上海生工合成。

1.2方法1.2.1序列设计合成已验证有效干扰HIF1α表达的siRNA 正义链序列为5'-GCCTCTTTGACAA ACTTAA -3'，依据pG1.1载体的插入位点和接头结构，设计合成两条互补的摘要目的：构建HIF1α-shRNA 表达载体并鉴定，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

方法：设计合成两条互补的编码HIF1α-shRNA 的DNA 寡核苷酸单链，退火形成互补双链，后将退火产物与酶切线性化的表达载体pG1.1连接后，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒并酶切鉴定，挑取克隆正确的重组质粒去测序鉴定插入序列。

结果：重组质粒酶切结果显示退火片段连接到pG1.1载体里，经测序分析重组质粒插入序列与合成的寡核苷酸序列一致。

建立重组缺氧诱导因子－1α真核表达载体质粒目的：建立重组人HIF－1α真核表达载体质粒pcDNA3－rhHIF－1α，为进行人HIF－1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究做准备。

方法：从人血细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成eDNA。

酶切插入pcDNA3载体。

结果：获得重组的人HIF－1α真核表达载体质粒pcDNA3－rhHIF－1α，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，测序插入pcDNA3载体部位正确。

结论：重组的人HIF－1α，所选用的pcDNA3可高表达目的基因，为利用其进行人HIF －1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基础。

标签：缺氧诱导因子；载体；质粒缺氧诱导因子(HIF)是1992年由Semenza等发现的一种氧依赖转录激活因子，通过与低氧反应元件(HRE)结合，引发下游基因的转录。

HIF－1是由α亚基和β亚基组成的异二聚体。

HIF－1β为其组成性表达，HIF－1α为其功能性亚基，HIF－1α极不稳定，在常氧条件下，半衰期不到10min，与其降解有关的结构域称为氧依赖的降解结构域(oxygen-dependent degrada-tion domain，ODD)(氨基酸401～603)。

本实验的目的是通过分子克隆的方法在体外重组HIF－1α，将ODD 结构域删除，使重组的人HIF－1α在正常血氧分压状态下能够在酵母细胞内进行表达，将表达产物免疫小鼠或兔子，提取抗体。

检测抗体的中和活性，观察抗体能否减轻模型动物的炎症反应。

1 材料与方法1．1材料pcDNA3，pMDl8－T Simple vector(简称T载体)、大肠杆菌JM109、质粒纯化试剂盒、cDNA RT－PCR试剂盒、RNA LAPCR试剂盒、LA Taq PCR试剂盒、Ligation试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR Fragment Recovery试剂盒、BKL试剂盒、工具酶KpnI、XbaI和EcoR V及碱性磷酸酶，DNA marker购自Takara。

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定概述HIF1α（hypoxia-inducible factor 1α）是哺乳动物生物体中重要的一种转录因子，它在缺氧的条件下被激活，可以调控多种与氧代谢相关的基因的表达，如糖酵解酶、血管生长因子等。

因此，HIF1α在肿瘤等重要疾病的发生和发展中起着重要作用。

目前，HIF1α-shRNA技术已经成为研究HIF1α生物活性以及干预疾病发展的重要手段之一。

本文主要介绍了HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定方法。

材料与方法（1）设计合成shRNA（2）合成DNA片段并克隆到质粒中（1）PCR检测（2）酶切鉴定（3）测序鉴定结果与讨论HIF1α-shRNA表达载体的构建，主要涉及到两个方面：shRNA的设计与合成，DNA片段的克隆。

在shRNA的设计与合成中，我们首先需要根据目标序列（目标为HIF1α）的特点及shRNA的结构，设计合成适合的shRNA。

其中，我们需要考虑到shRNA的长度、启动子的选择、短发夹RNA和长发夹RNA 的选择等因素。

在本实验中，我们采用了U6启动子，以及预测得到的两个长度分别为21 bp的短发夹RNA和51 bp的长发夹RNA。

接下来，我们利用化学法合成了该shRNA，并将其克隆到带有CMV启动子的质粒中，构建了HIF1α-shRNA表达载体。

HIF1α-shRNA表达载体的鉴定可以从多个方面进行，如PCR检测、酶切鉴定、测序鉴定等。

在本实验中，我们使用了PCR、酶切和测序三种方法对所构建的HIF1α-shRNA表达载体进行了鉴定。

首先，我们使用包含U6启动子和shRNA序列的通用引物，进行PCR扩增。

结果显示，我们成功扩增出了预期长度的DNA片段。

为了进一步确认所扩增的DNA片段是否为HIF1α-shRNA表达载体，我们进行了酶切鉴定。

结果显示，我们得到的DNA片段与已有文献报道的HIF1α-shRNA表达载体的预期DNA片段大小一致。