腺病毒和反转录病毒载体及其在基因治疗中的应用进展-文献综述

腺病毒和反转录病毒载体及其在基因治疗中的应用进展（南京农业大学生命科学学院生命基地111班）摘要：本文首先介绍了最应用最广泛的Baltimore病毒分类系统，然后引用最新的The Journal of Gene Medicine的数据，展示了最新的基因治疗和载体情况，最后对腺病毒和反转录病毒在基因治疗中尤其是在临床医学治疗中的近年来应用情况。

关键词：腺病毒载体；反转录病毒载体；基因治疗Adenovirus and retrovirus vectors and advances of their application in gene therapy (College of Life Sciences,Nanjing Agricultural University)Abstract:This paper first introduced the most popular Baltimore virus classification system.Then,I cited data statistical data from The Journal of Gene Medicine, in order to show how gene therapy and vectors for it have developed. At last,I reviewed the up to date application of different adenovirus and retrovirus vectors in gene therapy, especially in clinical application.Key words: adenovirus vectors; retrovirus vectors;gene therapy病毒载体是基础生物学研究中常用的遗传物质传递的载体。

随着对病毒的遗传机制和致病机理的深入研究，越来越多的病毒载体被用于人类疾病的诊断和治疗。

病毒载体应用于基因诊断有曲折的历史。

起初被认为在充分了解病毒的分子和遗传机理的情况下，可用于之治疗任何疾病。

但是，1999年，宾夕法尼亚大学用经改造的腺病毒载体治疗一位18岁患有鸟氨酸转氨嫁酰酶部分缺失症男性，导致病人死亡；2002-2003年MLV载体在被用于治疗患有人类联合免疫缺陷症XI时，导致部分病人出现了类似白血病的病症[1]。

以上问题都归因于对病毒载体和宿主之间的相互作用不了解。

自此，人们开始更加注重对载体生物学和药理学的研究。

过去的十多年时间里，人们花了大量的精力研究病毒载体和其与宿主的互作，本文着重讨论近年来在基因诊疗中腺病毒和反转录病毒载体应用的进展情况。

1病毒载体和基因治疗1.1 病毒分类Baltimore分类系统根据病毒的核酸类型、核酸链的类型（单链或双链）、正负链和复制类型将病毒分为七类：表1：Baltimore分类系统ds:双链；ss:单链基因治疗首先被设计应用于遗传性单基因疾病[2]，如今获得性疾病例如癌症[3]、心血管疾病[4]、神经变性疾病[5]和传染病[6]都是很多基因治疗研究的范畴。

由于病毒的多样性，用于基因治疗的病毒载体也是多样的，他们各具特点。

1.2 基因治疗统计The Journal of Gene Medicine (Wiley Database)对世界范围内1996项完成的或正在进行的基因疗法涉及的疾病和载体种类进行了统计，如下图所示：图一基因治疗的疾病种类样本总量：n=1996；Cancer diseases：癌症；Monogenic diseases：单基因病；Infectious diseases：传染病；Cardiovascular diseases：心血管疾病；Neurological diseases：神经疾病；Ocular diseases：眼科疾病；Inflammatory diseases：炎症性疾病由图一可以看出，研究最广泛的是癌症，其次是单基因疾病，再次是传染性疾病，心血管疾病位居第四。

图二基因治疗的载体样本总量：n=1996；Adenovirus：腺病毒；Retrovirus：逆转录病毒；Vaccinia virus：牛痘病毒；Adeno-associated virus：腺伴随病毒；Poxvirus：痘病毒；Lentivirus：慢病毒；Herpes simplex virus：单纯疱疹病毒由图二可以看出，腺病毒和逆转录酶病毒是应用最广泛的两类病毒载体。

牛痘病毒、腺伴随病毒、痘病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒均有不同程度的使用。

因为慢病毒是逆转录病毒的一种，所以逆转录病毒载体的使用比例可达22.7%。

下文将综述腺病毒载体和逆转录病毒载体这两种使用比例最高的载体在基因诊断中的应用。

2腺病毒载体腺病毒（Adenovirus）是中等体积的（90-100nm），无包被病毒，其二十面体核衣壳包含一条双链DNA，在Baltimore分类系统中属于I类。

腺病毒常导致温和的感染，感染部位包括上下呼吸道、胃和肠道以及结膜[7]。

目前，人们共发现了53种人类腺病毒血清型[8]，它们被分为六组，分别为A-F。

在针对人类免疫缺陷疾病的治疗中，Ad5载体被Merck和NIH疫苗研究中心选用，因为相比较于痘病毒和DNA疫苗，它能激发人体更多的体液和细胞免疫应答[9]。

但2007年该研究被终止，由于受治疗的人有增加的HIV-1感染趋势，很多学者对其中的原因展开了研究[10]。

2012年，Hualin Li等发现了一种肌肉注射的腺病毒载体，可诱导rhesus猴中针对猿猴免疫缺陷病毒的T淋巴细胞应答，这种应答可在外周血和多种气管组织中持续2年[11]。

2013年，Wendy等比较分析了三种（Ad5，Ad26，Ad35）腺病毒载体对小鼠免疫缺陷病毒Gag-specific CD8+T细胞的诱导情况，发现除了Ad5型的腺病毒载体，其他血清型的载体在对抗HIV-1中也是有效的[12]。

腺病毒载体的另一应用是针对肝炎病毒。

2012年，Eleanor等发现一种腺病毒疫苗，该疫苗可引起人体针对肝炎C病毒的广泛而持续的T细胞应答[13]。

LI–RUNG HUANG等用腺病毒载体携带HBV（肝炎B病毒）基因组，注射入小鼠并成功构建了小鼠B型肝炎动物模型[14]。

腺病毒载体用于癌症的研究有其独特的优势：转染高效，负载能力强，没有插入基因，但是一些原因也制约了它在临床中的应用，例如：引起机体的免疫反应，对肝细胞的毒性，半衰期短，在靶位点聚集少等[15]。

一些研究对克服这些缺点做了尝试，2010年，Sergey等用DAF(decay-accelerating factor)-Displaying腺病毒载体进行实验，发现该载体降低了小鼠体液和细胞适应性免疫应答[16]。

2012年，Christina等发现了一种可与宿主细胞基因组稳定整合的HC-AdV（高容量腺病毒载体）载体[17]。

纳米技术与腺病毒载体的联合使用可提高腺病毒载体靶向的特异性[18]。

3逆转录病毒载体逆转录病毒（Retrovirus）在Baltimore分类系统中属于VI类病毒，外表层为脂蛋白封套，包被有一二十面体的核蛋白衣壳，是一类RNA病毒，它们可将遗传物质稳定地整合在宿主细胞中。

根据其致病性不同，可将其分为三类：致瘤病毒、慢病毒、泡沫病毒。

逆转录病毒中，用于基因治疗最常见的是伽马逆转录病毒载体（Gammaretroviral vectors）和慢病毒载体（lentiviral vectors）,泡沫病毒的研究仍处在临床前阶段。

大多数伽马逆转录病毒载体都是在鼠白血病病毒的基础上改造而来[19]。

因为其不含任何致病基因，重组的病毒载体只能感染一个细胞并且不能复制。

但他的缺点是只能感染增殖细胞，除非载体解体并把自己的cDNA整合到宿主基因组中[20, 21]。

因此，对于非增殖或分化终止的细胞（神经细胞），需要慢病毒来源的载体。

20名患有SCID（severe combined immunodeficiency）-X1的儿童使用编码IL2RG的伽马逆转录病毒载体治疗，18位儿童重建了免疫能力，但是，其中的5位在接下来的2-5年内出现了白血病，1位死亡[22, 23]。

对患病儿童的分析表明，白血病T细胞克隆引入了插入突变。

截至2008年，超过30位患有ADA-SCID（adenosine deaminase-severe combined immunodeficiency）的儿童通过伽马逆转录病毒载体治愈，其中大约67%没有检测到副作用[24]。

慢病毒载体主要基于HIV[25]，但是猿猴免疫缺损病毒或猫免疫缺陷病毒[26]、马免疫缺陷病毒[27]等改造而来的载体也有应用。

首项基于HIV病毒载体的对抗HIV病毒I期临床实验开始于2003年[28]，目前为止，还没有相关的插入突变的报道。

4结论与展望腺病毒载体和反转录病毒载体是目前基因诊疗中应用最广泛的载体，有较多成功的案例报道。

但是，这两种载体都有较多的缺陷，尤其是用于临床实验中，更应该谨慎对待。

对于腺病毒载体，以后应该考虑新血清型的载体，并且可与一些新技术结合；对于慢病毒载体，主要是构建一种不会导致插入突变的载体。

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