过氧化物酶染色液(联苯胺法)

过氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程。

3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程。

二、实验原理：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。

带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。

因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。

并选用一定pH的缓冲液。

同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。

迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。

另外，迁移率还受电渗现象的影响。

所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。

例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。

因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。

聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。

这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。

最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。

一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。

同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。

但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。

一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。

最常见的为0.05。

在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3)（3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。

责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-011.目的规范POX染色的操作，保证操作安全可靠运行，为临床提供准确可靠的结果。

2.SOP程序编写依据依据ISO15189：2003《医学实验室—质量和能力的专用要求》《过氧化物酶（POX）染色液使用说明书》《全国临床检验操作规程》（第3版）3.SOP变动程序本操作程序的变动，可由其使用的工作人员提出，报经专业主管和科主任签字批准，方可变更。

4.适用范围适用血细胞内过氧化物酶的染色测定，用于辅助诊断。

5.实验原理:粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

6.标本采集6.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。

凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。

6.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液6.3 标本采集要求6.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

6.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

7. 标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。

8. 标本运输：室温运输9. 标本要求：新鲜涂片，溶血、稀释标本不能作测定。

10. 试剂10.1 试剂名称：血细胞pox染色试剂10.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司10.3 试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期1年。

试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期1年。

责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-01试剂3：95％乙醇，室温避光保存。

试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。

tmb过氧化物酶显色TMB过氧化物酶显色TMB过氧化物酶显色是一种常用的酶标技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。

本文将介绍TMB过氧化物酶显色的原理、应用以及其在医学领域中的重要性。

一、原理TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）是一种常用的显色底物，它能够与过氧化氢在过氧化物酶的催化下发生氧化反应，产生蓝色的氧化产物。

这种反应可被光谱仪或比色计测定，从而间接测定酶的活性或抗原和抗体的结合程度。

二、应用TMB过氧化物酶显色广泛应用于酶标技术中。

例如，可以利用TMB 显色法测定酶的活性，通过测定显色产物的光吸收值来定量分析酶的活性。

此外，TMB过氧化物酶显色还可以用于检测抗原和抗体的结合程度，常见的应用包括ELISA（酶联免疫吸附实验）和免疫组化等。

三、医学应用TMB过氧化物酶显色在医学领域中有着重要的应用价值。

例如，在临床诊断中，可以利用TMB过氧化物酶显色技术检测特定抗原的存在，从而帮助医生判断患者是否患有某种疾病。

此外，TMB过氧化物酶显色还可以用于研究新药的效果，通过测定药物对特定酶的抑制能力来评估药物的活性和选择性。

四、重要性TMB过氧化物酶显色在生物医学研究和临床诊断中扮演着重要的角色。

它不仅可以快速、准确地测定酶的活性，还可以检测抗原和抗体的结合程度，为疾病的早期诊断提供了重要的手段。

此外，TMB 过氧化物酶显色还具有操作简便、成本低廉等优点，使其成为一种广泛应用的酶标技术。

TMB过氧化物酶显色是一种重要的酶标技术，其原理简单、应用广泛，并在医学领域中发挥着重要的作用。

通过TMB过氧化物酶显色技术，我们可以快速、准确地测定酶的活性，检测抗原和抗体的结合程度，为生物医学研究和临床诊断提供了有力的支持。

相信随着科学技术的不断进步，TMB过氧化物酶显色技术将在未来的研究中发挥更加重要的作用。

花粉生活力测定方法研究进展摘要：总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了各种方法的优缺点。

关键词：花粉花粉活力测定方法花粉是高等植物的雄性配子体，在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。

花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象，也是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理实验的重要材料。

花粉活力是花粉具有生长、萌发、或发育的能力。

在农业生产及农业常规杂交育种的中，研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。

农业生产和育种工作通常会遇到花期不一致带来的困难，为解决这一难题，保存花粉的活力成为重要手段，而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。

不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。

因此，掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有较高的作用和意义。

综合前人的研究结果，花粉生活力的检测方法可以分为四大类：①染色法；②萌发测定法；③田间授粉检测法；④形态测定法、无机酸检测法。

1染色法1.1TTC染色法TTC即2,3,5-氯代三苯基四氮唑，它是一种氧化还原染料，水溶液无色。

基本原理是[1]：当TTC渗入细胞后，遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子，由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物，由此来判断花粉的生活力。

具体操作步骤：①配制PH为7.17的磷酸缓冲液。

称取0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于100ml的蒸馏水中，调整pH为7.17。

②TTC溶液配制。

依据不同植物称取0.02～1.0g的TTC溶于100ml的磷酸缓冲液中，于棕色瓶中黑暗处保存。

③染色。

取少量花粉置于载玻片上，加上一滴TTC溶液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，然后放置于35℃的恒温箱中染色15～20min。

④镜检。

于10×10倍镜下观察，凡具有活力的花粉被染成红色，部分丧失活力的呈现粉红色，无色的是的或不育的花粉粒。

凌春英,肖恩等的研究[2]得出常温、黑暗条件下用TTC染色12h可达到较好的观察效果，并认为TTC法是大花蕙兰和墨兰花粉活力测定便捷、有效的方法。

过氧化物酶染色（Washburn法）1. 实验原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

2. 标本采集2.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。

凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。

2.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液2.3 标本采集要求2.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

2.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

3. 标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。

4. 标本运输：室温运输5. 标本拒收的标准：溶血、稀释标本不能作测定。

6. 试剂6.1 试剂名称：血细胞pox染色试剂6.2 试剂生产厂家：xx生物技术公司6.3 试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂3：95％乙醇，室温避光保存。

试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。

7. 操作步骤7.1 新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后室温放置5分钟，流水冲洗。

7.2 滴加95％乙醇脱色，水洗后瑞氏染色，复染后镜检观察结果。

8. 结果判断8.1 阳性—细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质，定位于胞质。

8.2 阴性—细胞内无棕黄色或蓝黑色颗粒。

9. 临床意义9.1 粒细胞系统呈集中状粗颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

网状细胞及吞噬细胞有不同程度的阳性。

9.2 淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

过氧化物酶(POX)染色[原理]粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。

受体被氧化成联苯胺蓝。

再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。

[试剂]1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。

贮于棕色瓶中，可保存数月。

工作时应小心溶液污染皮肤。

2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。

[操作](1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2分钟。

(2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。

(3)涂片用流水冲洗。

待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。

[结果观察]可报告阳性程度或阳性细胞％。

阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。

弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。

阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。

相当于(++)。

强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。

相当于(+++）。

[临床意义](1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含有不同程度的蓝色颗粒。

嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。

嗜碱性细胞为阴性。

(2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。

(3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。

(4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。

(5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的关键化学染色。

FAB分型规定前者阳性率＜3％。

编写：谢平制定日期：2011.12.1[附注](1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。

(2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热助溶后应用。

(3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。

双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。

涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。

细胞生物学实验报告（3篇）细胞生物学实验报告（精选3篇）细胞生物学实验报告篇1一、实验目的：1、掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。

2.了解细胞凋亡的生物学意义3、掌握凋亡细胞的形态学检测方法二、实验原理：1、细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。

中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。

2、细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。

它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。

3、凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体;根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。

三、实验步骤：细胞中过氧化物酶的显示1、在载片上滴一滴PBS缓冲液；2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上；3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。

5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）6、清水冲洗，番红复染2min。

7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100_）细胞凋亡的形态学检测与观察吉姆萨染色:1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞3、95%乙醇固定5min4、PBS缓冲液洗2次5、吉姆萨染色液染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液7、普通光学显微镜下观察。

吖啶橙染色:1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min4、PBS缓冲液洗2次每次1min5、0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。

实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。

关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。

同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。

电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。

50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。

60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。

这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。

引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。

化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。