过氧化物酶(POX)染色

责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-011.目的规范POX染色的操作，保证操作安全可靠运行，为临床提供准确可靠的结果。

2.SOP程序编写依据依据ISO15189：2003《医学实验室—质量和能力的专用要求》《过氧化物酶（POX）染色液使用说明书》《全国临床检验操作规程》（第3版）3.SOP变动程序本操作程序的变动，可由其使用的工作人员提出，报经专业主管和科主任签字批准，方可变更。

4.适用范围适用血细胞内过氧化物酶的染色测定，用于辅助诊断。

5.实验原理:粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

6.标本采集6.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。

凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。

6.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液6.3 标本采集要求6.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

6.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

7. 标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。

8. 标本运输：室温运输9. 标本要求：新鲜涂片，溶血、稀释标本不能作测定。

10. 试剂10.1 试剂名称：血细胞pox染色试剂10.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司10.3 试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期1年。

试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期1年。

责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-01试剂3：95％乙醇，室温避光保存。

试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。

过氧化物酶染色标准操作程序1.检验目的通过对血细胞内过氧化物酶的染色测定，可用于白血病细胞的鉴别与分型。

2.检测原理血细胞内过氧化物酶（POX）能将无色的二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，使前者变为有色染料沉积在细胞质酶所在部位。

1.标本新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。

2.试剂联苯胺液(A液)、H2O2(B液) 、瑞姬氏染液(C液) 、磷酸盐缓冲液(D液) 3.环境和安全5.1环境温度要求：2~8℃保存,有效期12个月。

5.2安全控制：工作中所有与病人的样本接触或有潜在性接触可能的样本都视为污染物。

在操作时有必要穿戴保护性的工作服、外套和手套。

在处理废弃样本时不可触摸废弃物，一定戴手套和护目镜以避免直接接触。

如果操作人员不小心接触血液、试剂、废弃物/皮肤或衣物上沾到了样本、试剂及废液，用大量清水冲洗并适当考虑必要的医疗措施。

4.操作步骤6.1新鲜的涂片滴加A染色液数滴(以覆盖涂片为宜),再滴加B染色液数滴(A 液:B液=1:1),混合后室温染色5~10分钟,流水冲洗2分钟，待干。

6.2然后用瑞姬氏染色(C液)与磷酸盐缓冲液(D液)1:2比例混合，对其染色3~5分钟,流水冲洗,干后镜检。

7.检验结果解释阴性------胞质内无沉淀物（无色）阳性------胞质内出现棕黄或蓝黑色沉淀物8.实验室临床解释8.1粒细胞系统呈集中状颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

8.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

8.3在白血病细胞的鉴别与分型中的应用：强阳性提示：FAB中的M1，M2，M3；部分强阳性与弥散状弱阳性提示：FAB中的M4；弥散状弱阳性提示：FAB中的M5；阴性提示：FAB中的M0，M5，M6，M7，ALL等。

9.变异潜在来源若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。

宜可使用某些抗凝血（肝素、EDTA），样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物酶被抑制或破坏。

过氧化物酶(P e r o x i d a s e,P O X)染色
联苯胺法
一.原理:粒细胞及一部分单核细胞胞浆内的颗粒含有过氧化酶.此酶能将过氧化氢中的氧释放出来,而把联苯胺氧化成氧化联苯胺,后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝色颗粒,沉着于细胞质中．
二.试剂配制:
1.复方联苯胺（Washburn）染液：联苯胺0.3克，95％乙醇99ml，36％亚硝基铁氰化钠1ml，此染液可保存10月或更久．
2.过氧化氢溶液：3％过氧化氢1滴，蒸馏水5ml．此液用时需新鲜配制．三．染色步骤：
1.于新鲜涂片滴加复方联苯胺染液3～8滴，使之盖满涂片．
2.1～2分钟后加入等量过氧化氢溶液．
3.8～10分钟后用水冲洗．
4.在空气中晾干后直接观察，或用瑞氏染液复染后进行观察．瑞氏染液复染时间为20分钟．
四.注意事项：
3％过氧化氢溶液需保证质量．其稀释液必须应用时新鲜配制．
联苯胺具有致癌性，染色时需加注意．
五．临床意义：
1.正常细胞反应：POX主要存在于粒系细胞中，除早期原粒细胞外，晚期原粒细胞及其后各阶段细胞均呈阳性反应，细胞越成熟，其阳性反应越强．原单细胞为阴性反应，幼稚和成熟单核细胞呈弱阳性反应．淋巴细胞系／巨核细胞系／红细胞系各阶段细胞均呈阴性反应．
2.急性白血病类型鉴别：急性粒细胞白血病时，其原幼细胞多呈阳性反应；急性单核细胞白血病时，其原幼细胞多呈弱阳性或阴性反应；急性淋巴细胞／巨核细胞性白血病时，因原幼细胞多呈阴性反应．。

实验十二常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。

联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。

试剂器材1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。

2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。

3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。

4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。

5．瑞氏(Wright)染色液。

6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。

操作步骤1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。

2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。

3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。

4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。

注意事顶1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。

2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。

3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。

涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。

若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。

4．染色液pH应为5.5。

骨髓细胞化学染色(一) 过氧化酶染色（POX）【结果判断】细胞中出现蓝绿色颗粒为阳性反应。

按颗粒大小和密集程度分为强阳性和弱阳性。

【临床意义】过氧气酶主要存在于粒细胞系统，除早期原始粒细胞外，其后各阶段均呈阳性反应。

单核细胞从幼稚单核细胞起呈弱阳性反应。

淋巴细胞各阶段均为阴性。

故对急性粒细胞白血病和急性淋巴细胞、急性粒细胞与急性单核细胞白血病的鉴别诊断有帮助。

急性淋巴细胞白血病全部阴性，急性单核细胞白血病POX颗粒细小、染色浅淡。

(二) 中性粒细胞碱性磷酸酶染色(NAP)碱性磷酸酶主要存在于成熟中性粒细胞中，其他细胞均阴性。

网状细胞及吞噬细胞的酶活性很强。

【结果判断】染色结果，在细胞浆中出现灰色至棕黑色颗粒者为阳性，阴性与阳性程度可表示为：(一) 胞浆呈淡红色，无颗粒。

(＋) 全部胞浆呈淡灰色，无颗粒。

或胞浆中出现棕黑色或黑色颗粒，但不超过整个细胞的1/4。

(十十) 同(＋)，胞浆呈灰色，或颗粒不超过细胞1/2。

(＋十十) 胞浆内充满棕黑色或黑色颗粒，但尚不十分致密，范围可超过整个细胞的3/4。

(十十十十) 颗粒粗大稠密，甚至遮盖细胞核。

以积分值表示：正常人阳性率一般在40%左右，NAP积分值80分左右，以弱阳性为主。

【临床意义】(1) 急性白血病与中性粒细胞类白血病样反应的鉴别。

前者NAP减弱，后者活性明显增强。

(2) 慢性粒细胞性白血病时降低。

阵发性睡眠性血红蛋白尿患者的成熟粒细胞NAP降低。

(3) 急性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、骨髓硬化症患者NAP明显增强。

(4) 再生障碍性贫血时NAP增强，而其他类型贫血多无变化。

(5) 激素的影响，垂体肾上腺皮质功能亢进，或应用皮质激素时NAP增强。

妊娠亦出现 NAP 增强。

(三) 糖原染色 (PAS)糖原存在于细胞浆内，粒系统细胞自早幼粒细胞开始就可呈现阳性，阳性程度随细胞成熟而增强。

成熟中性分叶粒细胞糖原最为丰富。

单核细胞呈弱阳性。

过氧化物酶染色（POX）的临床意义一、正常血细胞的染色反应1.粒细胞系统分化差的原粒细胞为阴性，分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性；且随着细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强。

中性分叶核粒细胞为强阳性反应，但衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性；嗜酸性粒细胞阳性最强，其阳性颗粒粗大、有折光性；嗜碱性粒细胞阴性。

2.单核细胞系统大多数单核细胞系统的细胞呈阴性或弱阳性，阳性颗粒少而细小。

3.其他细胞淋巴细胞系统、红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性，浆细胞、组织细胞也呈阴性，吞噬细胞有的呈阳性。

二、临床意义POX染色是临床上辅助判断急性白血病细胞类型首选、最重要的细胞化学染色。

但在观察要辨认的细胞POX染色结果前，首先要注意观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。

1．帮助鉴别急性白血病的类型（1）急性粒细胞白血病，白血病性原始粒细胞可呈阳性反应，阳性颗粒一般较多，较粗大，常呈局限性分布，但阴性时也不能排除本病；急性淋巴细胞白血病时，原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞均呈阴性反应，但可有少许阳性细胞，此系残留的原粒细胞，故FAB分型规定急性淋巴细胞白血病其阳性率< 3%。

急性单核细胞白血病时，白血病原始单核细胞呈阴性反应，有时虽少数可呈弱阳性反应，但阳性颗粒少而细小，常弥散分布。

（2）小型原始粒细胞和原始淋巴细胞不易区别，如果小型原始细胞呈过氧化物酶阳性反应，可确定为小型原始粒细胞。

（3）急性早幼粒细胞白血病有时须与急性单核细胞白血病鉴别，如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性反应，应确定为急性早幼粒细胞白血病。

（4）急性单核细胞白血病有时须与组织细胞白血病和恶性组织细胞病相鉴别，异常组织细胞的过氧化物酶呈阴性反应，而白血病性幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性反应。

2．成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化（1）活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染（特别是化脓性细菌感染）、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。

常用血细胞化学染色原理及应用（1）过氧化物酶染色的原理和临床意义[原理] 粒细胞和单核细胞胞浆中含有的过氧化物酶（peroxidase，POX）能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。

联苯胺蓝自我脱氢氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆内酶所在的部位。

[临床意义]临床上主要用于急性白血病类型的鉴别：急性淋巴细胞白血病原、幼淋巴细胞POX染色均呈阴性反应；急性粒细胞白血病原粒细胞POX 染色呈局灶分布的阳性反应；急性早幼粒细胞白血病颗粒增多的早幼粒细胞POX染色呈强阳性反应；急性单核细胞白血病原、幼单核细胞POX染色多呈细小颗粒弱阳性反应。

（2）过碘酸-雪夫染色的原理和临床意义[原理] 过碘酸-雪夫（Pexiodic acid-schiff，PAS）染色又称糖原染色。

胞浆内存在的糖原或多糖类物质（如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（Periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。

该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。

[临床意义]1）急性白血病类型的鉴别红白血病的幼红细胞PAS染色多呈阳性反应，阳性率高，反应强；成熟红细胞有时亦可为阳性；急性淋巴细胞白血病的原、幼淋巴细胞PAS染色多为红色颗粒或块状阳性反应；急性粒细胞白血病的原粒细胞呈阴性或胞质呈弥漫淡色阳性反应；急性早幼粒细胞白血病异常早幼粒细胞的PAS染色为阳性反应；急性单核细胞白血病原、幼单核细胞PAS染色阳性反应呈弥漫分布的红色细颗粒，巨核细胞白血病原巨核细胞PAS染色呈阳性或强阳性反应，表现为红色颗粒或块状。

2）各类贫血的鉴别 MDS、缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血（曾称地中海贫血）的幼红细胞PAS染色多为阴性反应，有时可出现阳性反应；巨幼红细胞贫血、溶血性贫血、再障的幼红细胞PAS染色为阴性。