植物过氧化物酶的提取、

一、实验目的1. 了解洋葱过氧化物酶的分布情况。

2. 掌握测定洋葱过氧化物酶活性的方法。

3. 分析洋葱过氧化物酶在不同处理条件下的活性变化。

二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，具有催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）的功能。

在实验中，通过测定过氧化氢分解速率来间接反映过氧化物酶的活性。

本实验采用TMB法测定洋葱过氧化物酶活性，TMB在过氧化物酶的作用下，会生成蓝色的化合物，通过测定蓝色化合物的吸光度，可以计算出过氧化物酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱、蒸馏水、TMB溶液、过氧化氢溶液、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、冰浴等。

2. 实验仪器：分光光度计、电子天平、研钵、移液器、试管等。

四、实验方法1. 洋葱过氧化物酶提取液的制备：取洋葱鳞片叶，用蒸馏水冲洗干净，剪碎后加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），在冰浴中研磨，制成洋葱过氧化物酶提取液。

2. TMB反应体系的制备：取一定量的TMB溶液和过氧化氢溶液，混合均匀，加入磷酸盐缓冲液（pH 6.0），配制成TMB反应体系。

3. 过氧化物酶活性测定：取一定量的洋葱过氧化物酶提取液，加入TMB反应体系，在特定波长下测定吸光度，根据吸光度变化计算过氧化物酶活性。

五、实验结果与分析1. 洋葱过氧化物酶的分布情况：通过对洋葱不同部位（叶片、鳞片叶、茎）的过氧化物酶活性测定，发现洋葱叶片中过氧化物酶活性最高，其次是鳞片叶和茎。

这表明过氧化物酶在洋葱叶片中分布较为集中，可能与叶片的光合作用、氧化还原反应有关。

2. 不同处理条件下过氧化物酶活性的变化：将洋葱过氧化物酶提取液分别置于不同温度（0℃、25℃、50℃）、不同pH值（pH 4.0、pH 6.0、pH 8.0）条件下处理，测定过氧化物酶活性。

结果显示，在适宜的温度（25℃）和pH值（pH 6.0）条件下，过氧化物酶活性最高。

这表明洋葱过氧化物酶活性受温度和pH值的影响较大。

一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。

二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。

在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。

反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。

愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。

将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。

2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。

取出试管，立即放入冰浴中终止反应。

使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。

3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。

根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。

过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。

其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL 。

过氧化物酶活性的测定愈创木酚法目的意义过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、物抗性密切相关。

通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法及其原理。

过氧化物酶催化H202氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的产物。

本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H202将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。

三、材料、设备和试剂1．材料马铃薯或小麦芽、未成熟的苹果、新鲜茶叶等。

2．设备 721型分光光度计、离心机、秒表(或手表)、天平、研钵、磁力搅拌器。

3．试剂愈创木酚、30％过氧化氢、20mmol/L KH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6．0)。

反应混合液配制取100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28µl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19µl 以，混合均匀，保存于冰箱中。

三、操作方法1．酶液制备称取植物材料1g，加入20mmol/L KH2PO4溶液5m1，于研钵中研磨成匀浆，在33000r/min 下离心10min，上清液转入25m1容量瓶中，残渣再用5ml KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮于冷凉处备用。

2．比色测定取光径1cm比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3m1，KH2PO4溶液1ml，作为参比液；另一只中加入反应混合液3ml，酶液1m1(如酶活性过高可稀释之)，立即记时并置于分光光度计中。

在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。

若气温较低，应适当提高室温，以37℃为最适宜。

四、实验结果1．以时间为横坐标，光密度为纵坐标作图。

反应前期过氧化氢酶活性随反应时间直线上升，升到最大值后，其相关曲线出现转折点，转折出现的早晚取决于温度。

一种过氧化物酶的提取方法介绍如下:
过氧化物酶是一种重要的水解酶，在生物医药、食品工业等领域有着广泛的应用价值。

下面我们来介绍一种可行的过氧化物酶的提取方法：
提取方法：
1.准备新鲜植物、肝脏或其他组织或细胞培养物。

2.将组织或细胞用生理盐水洗净，然后切成小块。

3.加入适量的冰冷酒精，浸泡3-4小时，使细胞破裂可释放出过氧化物酶。

4.轻轻搅拌，然后过滤去除细胞残渣，得到纯化的过氧化物酶。

5.使用离子交换色谱和凝胶过滤等色谱方法，对提取得到的酶进行纯化。

6.通过测定酶活性，确定其纯度和酶活性。

7.最后，将得到的纯化酶溶液进行减压冷冻干燥或冻干，存放于低温处备用。

此提取方法的优点在于，具有简单易行、操作方便、纯度较高等特点，同时可以获得良好的酶活性和稳定性。

然而，在实际操作的过程中，还需要注意控制提取温度、时间和酒精浓度等因素，以使提取效果更加理想。

此外，还可以使用其他提取方法，比如超声波辅助提取、酸碱法提取、酶学法提取等，每种方法都有其各自的适用范围和优缺点，需要根据具体情况进行选择。

2018年8月m i tJournal of Green Science and Technology第16期大豆过氧化物酶的提取与分离纯化研究刘力(武汉华测检测技术有限公司食品实验室，湖北武汉430223)摘要：利用超声辅助法提取大豆过氧化物酶（P O D酶），对大豆不同部位P O D酶含量进行了比较，采用硫酸铵一丙酮沉淀法对P O D酶进行了分离纯化，结果得到的大豆胚芽P O D酶的比活力是豆壳P O D酶的2. 61倍，较豆壳而言大豆胚芽为P O D酶提取的最佳原料。

经硫酸铵沉淀、丙酮沉淀和硫酸锌除杂后，大豆P O D 酶活力为13765.00U/m L,蛋白质浓度为3. 11m g/m L,酶的比活力为4432. 52U/m g,R z值 1. 59,且纯化倍数达38. 30。

同时，经S D S—P A G E电泳分析后，可推断出该大豆P O D酶的分子量大约在65〜95k b之 间，且只出现了一个条带，可看出纯化效果较好。

关键词：过氧化物酶;提取；分离纯化中图分类号：Q814文献标识码：A文章编号=1674-9944(2018)16-0256-041引言大豆过氧化物酶（POD)是从豆壳或大豆胚芽中提 取的一种活性很高的过氧化物酶，是由单一肽链和卟琳 构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合能 构成全酶[1]。

分子量为37000D,300多个氨基酸残基组 成，等电点为3.9,是酸性蛋白质[2]。

大豆POD酶由两 个结构域组成，中间是血红素辅基，Kamal[3]等推出由 77%的螺旋、16%的|3 —折叠和p—转角及其它结构 组成其结构域。

大豆过氧化物酶和辣根过氧化物酶的 结构及作用机理有许多相似之处，都属于植物过氧化物 酶超家族的D I类酶[4]。

它们具有相似的三维折叠模式，氨基酸序列有57%的同源性，两者都含有1个色氨酸，2个Ca2+，4个二硫键和8个多糖。

现在，对辣根过氧 化物酶的研究较成熟，大豆过氧化物酶的研究甚少。

植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学及分子特性一、本文概述植物抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，AP）是一种在植物细胞内广泛存在的关键酶，其在植物抗氧化防御系统中发挥着至关重要的作用。

本文旨在全面探讨植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制、酶学特性以及分子特性，以期为深入理解植物抗氧化防御系统的运行规律，以及提高植物抗逆性和农业生产力提供理论基础。

我们将详细介绍抗坏血酸过氧化物酶的生化功能，包括其催化抗坏血酸清除活性氧的能力及其在细胞氧化还原稳态中的作用。

接着，我们将深入探讨抗坏血酸过氧化物酶的酶学性质，如酶的动力学特性、抑制剂和激活剂的影响等。

我们将对抗坏血酸过氧化物酶的分子特性进行阐述，包括其基因结构、表达调控以及蛋白质结构等方面的研究。

通过本文的综述，我们期望能够为植物生物学、农业生物技术以及植物抗逆性研究等领域提供有益的参考和启示。

二、植物抗坏血酸过氧化物酶的作用机制植物抗坏血酸过氧化物酶（AP）是一种关键的抗氧化酶，主要作用是清除植物细胞中的过氧化氢（H2O2），以防止氧化应激对细胞造成的损伤。

AP的作用机制主要涉及到酶的催化活性以及其与底物的相互作用。

在AP的催化过程中，抗坏血酸（AsA）作为还原剂，将H2O2还原为水（H2O），而自身则被氧化为单脱氢抗坏血酸（DHA）。

这个过程可以表示为：2AsA + H2O2 → 2DHA + 2H2O。

DHA随后通过抗坏血酸再生系统被还原回AsA，从而维持了AP的催化循环。

AP的作用机制还涉及到其在细胞内的定位。

在植物细胞中，AP 主要分布在叶绿体、细胞质和线粒体等细胞器中。

这些细胞器中的AP通过特定的信号肽序列被定位到相应的位置，从而实现了对特定区域H2O2的高效清除。

AP的活性还受到多种因素的调节，包括光照、温度、pH值以及底物和抑制剂的浓度等。

光照和温度可以影响AP的稳定性和活性，而pH值则可以影响AP与底物的结合能力。