POX染色方法
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POX染色SOP
责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-011.目的规范POX染色的操作，保证操作安全可靠运行，为临床提供准确可靠的结果。
2.SOP程序编写依据依据ISO15189：2003《医学实验室—质量和能力的专用要求》《过氧化物酶（POX）染色液使用说明书》《全国临床检验操作规程》（第3版）3.SOP变动程序本操作程序的变动，可由其使用的工作人员提出，报经专业主管和科主任签字批准，方可变更。
4.适用范围适用血细胞内过氧化物酶的染色测定，用于辅助诊断。
5.实验原理:粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。
6.标本采集6.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。
凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。
6.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液6.3 标本采集要求6.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。
6.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。
小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。
7. 标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。
8. 标本运输：室温运输9. 标本要求：新鲜涂片，溶血、稀释标本不能作测定。
10. 试剂10.1 试剂名称：血细胞pox染色试剂10.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司10.3 试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期1年。
试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期1年。
责任部门：检验科程审核：肖启国批准：卿文衡实施：2011-01-01试剂3：95％乙醇，室温避光保存。
试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。
过氧化物酶(POX)染色
过氧化物酶(POX)染色[原理]粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。
受体被氧化成联苯胺蓝。
再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。
[试剂]1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。
贮于棕色瓶中，可保存数月。
工作时应小心溶液污染皮肤。
2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。
[操作](1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2分钟。
(2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。
(3)涂片用流水冲洗。
待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。
[结果观察]可报告阳性程度或阳性细胞％。
阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。
弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。
阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。
相当于(++)。
强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。
相当于(+++）。
[临床意义](1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含有不同程度的蓝色颗粒。
嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。
嗜碱性细胞为阴性。
(2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。
(3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。
(4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。
(5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的关键化学染色。
FAB分型规定前者阳性率＜3％。
编写：谢平制定日期：2011.12.1[附注](1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。
(2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热助溶后应用。
(3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。
双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。
涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。
细胞化学染色
【注意事项】
1．过氧化氢必须新鲜配制。过氧化氢的最适 浓度是0．05mol／L左右，浓度过高，反 而抑制酶作用。一般采用5ml蒸馏水，加3 ％过氧化氢一滴。若用30％的过氧化氢时 ，只能在100ml蒸馏水中加1～2滴。涂片 中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色 或绿色，即示过氧化氢过浓。若过氧化氢 加于血片上不产生气泡，则示无效。
2．2g／L核固红-硫酸铝溶液 取硫酸铝2g溶于 100ml蒸馏水中，再加入核固红 (Emerk出品 )0.2g。置37℃水浴中1h并随时振荡，使溶解， 过滤后使用。
【步骤和方法】
1.选骨髓小粒丰富的骨髓片，用甲醇固定 10min，待干。
2．玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，染色 30min(可置37℃环境)
3．水洗时勿在水流下猛冲，以免髓粒脱 落。
3．用于诊断铁粒幼红细胞性贫血 这时能 找到数量不等的环型铁粒幼红细胞，并多 见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼红细胞。
【注意事项】
1．玻璃片需经无铁处理 将新片经清洁液 浸泡24h，取出反复水洗后浸入95%酒精 中24h，晾干，再浸泡在5％盐酸中24h， 用双重蒸馏水反复浸洗玻片，取出烤干后 备用。
2．酸性亚铁氰化钾液须新鲜配制。
1．急性粒细胞白血病：细胞分化较好时，原 始粒细胞呈阳性反应，阳性率可>30%， 在分化较差的白血病，如AML-M0和未分 化型（AML-M1）的部分病例，原粒细胞 的POX染色也可呈阴性。
2．急性早幼粒细胞白血病时白血病细胞呈强 阳性反应。
3．急性淋巴细胞呈阴性反应，FAB分型规定 POX阳性率<3％。
(++)：有较多的铁颗粒和小珠。
(+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小 块状。
过氧化物酶染色液(联苯胺法)
南京森贝伽生物科技有限公司 网址：/第1页 仅供科研版本号：171024过氧化物酶染色液(联苯胺法)【产品组成】【保存条件】4℃,避光 ,6个月【产品概述】过氧化物酶(Peroxidase ，简称POX 或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
过氧化物酶染色液(联苯胺法)是ICSH 推荐采用的POX 染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB)的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX 所在部位。
该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX 活性部位呈棕黄色。
【使用方法】1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA 固定液，4℃固定30～60s ，稍水洗。
2、滴加配制好的POX 孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min ，水洗2min 。
3、滴加WG 染色液，孵育30～60s 。
4、直接滴加等量WGbuffer ，染色10～15min 。
5、水洗、晾干、镜检。
【染色结果】粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。
浆细胞及巨核细胞均为阴性。
嗜酸性粒细胞和Auer 小体呈强阳性反应。
阳性反应强度的判断：【临床意义】1、急性粒细胞白血病晚期的原粒细胞呈阳性，颗粒较少且大。
2、急性单核白血病细胞呈阴性或弱阳性，颗粒小且稀疏。
3、单核急性白血病呈阴性或弱阳性。
4、急性早幼粒白血病呈强阳性，某些早幼粒细胞呈阳性，恶性组织细胞呈阴性。
5、急性淋巴细胞白血病呈阴性。
【注意事项】1、血液或骨髓涂片应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。
2、POX孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。
PO 染色方法
过氧化物酶( Peroxidase , POX ) 染色
联苯胺法
一. 原理: 粒细胞及一部分单核细胞胞浆内的颗粒含有过氧化酶.此酶能将过氧化氢中的氧释放出来,而把联苯胺氧化成氧化联苯胺,后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝色颗粒,沉着于细胞质中．
二.试剂配制:
1.复方联苯胺（Washburn）染液：联苯胺0.3克，95％乙醇99ml，36％亚硝基铁氰化钠1 ml，此染液可保存10月或更久．
2.过氧化氢溶液：3％过氧化氢1滴，蒸馏水5 ml．此液用时需新鲜配制．
三．染色步骤：
1.于新鲜涂片滴加复方联苯胺染液3～8滴，使之盖满涂片．
2.1～2分钟后加入等量过氧化氢溶液．
3.8～10分钟后用水冲洗．
4.在空气中晾干后直接观察，或用瑞氏染液复染后进行观察．瑞氏染液复染时间为20分钟．
四.注意事项：
3％过氧化氢溶液需保证质量．其稀释液必须应用时新鲜配制．
联苯胺具有致癌性，染色时需加注意．
五．临床意义：
1.正常细胞反应：POX主要存在于粒系细胞中，除早期原粒细胞外，晚期原粒细胞及其后各阶段细胞均呈阳性反应，细胞越成熟，其阳性反应越强．原单细胞为阴性反应，幼稚和成熟单核细胞呈弱阳性反应．淋巴细胞系／巨核细胞系／红细胞系各阶段细胞均呈阴性反应．
2.急性白血病类型鉴别：急性粒细胞白血病时，其原幼细胞多呈阳性反应；急性单核细胞白血病时，其原幼细胞多呈弱阳性或阴性反应；急性淋巴细胞／巨核细胞性白血病时，因原幼细胞多呈阴性反应．。
实验十二常用血细胞化学染色
实验十二常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。
联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。
试剂器材1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。
2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。
3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。
4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。
5．瑞氏(Wright)染色液。
6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。
操作步骤1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。
2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。
3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。
4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。
注意事顶1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。
2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。
3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。
涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。
若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。
4．染色液pH应为5.5。
临床血液学检验：实验四 过氧化物酶染色(POX)
涂片滴加A液3滴固定60秒 （DW冲洗，待干）
滴加B液（高碘酸）3滴氧化10 min， DW冲洗，待干
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
操作步骤
滴加C液（雪夫染液） 3滴氧化15 min， DW冲洗 待干
滴加D液（甲绿） 3滴复染5分钟
DW冲洗 待干
镜检
结果
阳性反应：胞质内染红色或紫红色，呈弥 散状、颗粒或块状。胞核染成绿色。
滴加D液（甲绿） 3滴复染5分钟
滴加C液3滴，D液6滴混匀
5分钟
甩干，镜检
DW冲洗 待干 镜检
CLL
ALL
ALL
ALL中粗 粗粒散在分布
A:红白血病
B:巨幼贫
M6 PAS 染色
•
POX
新鲜涂片
PAS
涂片滴加A液3滴固定60秒 （DW冲洗，待干）
滴加A液3滴（覆盖标本即可）滴加B液（高碘酸） 3滴氧化10 min， DW冲洗，待干 然后
滴加等量B液3滴,吹匀 10分钟
水洗，甩干
滴加C液（雪夫染液） 3滴氧化15 min， DW冲洗 待干
• 结果判断（100×）
胞浆中出现红棕色至蓝黑色颗粒为阳性反应
• （—）无颗粒沉着 • （弱+） 颗粒细小，分布稀疏 • （+）颗粒较粗常呈局灶性分布 • （++）颗粒粗大分布较密占胞浆1/2~2/3 • （+++）颗粒粗大，呈团块状分布 • （++++）颗粒布满细胞，可覆盖胞核
• 正常参考值
• 正常人淋巴细胞、红细胞、巨核细胞、成 熟嗜 碱性粒细胞，均无POX；
• 粒细胞系统：早幼粒以下阶段细胞均为 阳性，且逐渐加强，嗜酸粒细胞阳性最强
过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)
（19）中华人民共和国国家知识产权局（12）发明专利申请（10）申请公布号CN103884563A（43）申请公布日 2014.06.25（21）申请号CN201410142884.4（22）申请日2014.04.10（71）申请人上海太阳生物技术有限公司地址201108 上海市闵行区金都路3419号（72）发明人谢永华;朱美萍;许付;季娜（74）专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司代理人赵青朵（51）Int.CI权利要求说明书说明书幅图（54）发明名称过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)（57）摘要本发明属于医学体外诊断领域，公开了一种过氧化物酶的染色液。
本发明所述染色液包括显色剂、过氧化物、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮和环丙沙星；所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺或其酸式盐。
本发明采用1,3-二甲基-2-咪唑烷酮作为显色剂的溶剂，提高了染色液的稳定性和检测灵敏度；采用环丙沙星作为稳定剂，能够使显色剂和过氧化物长期稳定共存于缓冲液中。
本发明染色液增强了染色液的稳定性，降低了背景颜色，可室温放置，多次使用，试剂安全简单，无生物有害性和毒性，且测定时灵敏度较高，广泛适合于临床血细胞内过氧化物酶的染色测定。
法律状态法律状态公告日法律状态信息法律状态2014-06-25公开公开2014-07-16实质审查的生效实质审查的生效2016-08-17授权授权权利要求说明书过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)的权利要求说明书内容是....请下载后查看说明书过氧化物酶(POX)染色液(化学染色法)的说明书内容是....请下载后查看。
过氧化物酶染色实验
注意事项：
1. 标本应及时固定； 2. 标本未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂等； 3.每次应设阴、阳性对照。
临床意义：
主要用于鉴别急性白血病的类型 1. 急粒：原粒细胞呈阳性反应(+) ~ (+++) 2. 急淋：呈阴性反应(–) 3. 急单：呈弱阳性，急粒单中的原粒、
早幼粒呈强阳性，幼单呈弱阳性。
不同而产生棕黑色颗粒沉着于细胞内。
试剂：
1. Ⅰ液：乙醇、二氨基联苯胺、亚硝基铁 氰化钠、稳定剂等
2. Ⅱ液：H2O2
操作方法：
1. 新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴，室温放置1分 钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后 室温放置5分钟，流水冲洗；
2. 瑞氏染色复染20分钟，流水冲洗后油 镜观察结果。
结果判断：
过氧化物酶染色 实验要求： 1. 掌握过氧化物酶染色的原理、操作、注意
事项、结果判断； 2. 熟悉正常细胞、病理细胞的染色反应及临
床意义。
过氧化物酶染色 (peroxidase pox)
原 理：
血细胞内的过氧化物酶能将底物H2O2 氧化释出新生态氧，后者氧化联苯胺，使之
变成联苯胺蓝，后者显色情况随pox的活力
1. 阴性：胞质内无沉淀物（无色）； 2. 阳性：胞质内出现棕黄或蓝黑色沉淀物； 3. 强阳性
1. 粒系：原粒(–) →早幼粒(+) →成熟中性粒 (阳性 渐强) ；嗜酸粒(+++) ，其颗粒粗大，有 折光性；嗜碱粒(–)；
2. 单核系：原单(–)；幼单、成熟单(±)； 3. 其他：淋巴系、红系、巨核C系、浆C系均(–)。
POX染色方法
过氧化物酶(P e r o x i d a s e,P O X)染色
联苯胺法
一.原理:粒细胞及一部分单核细胞胞浆内的颗粒含有过氧化酶.此酶能将过氧化氢中的氧释放出来,而把联苯胺氧化成氧化联苯胺,后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝色颗粒,沉着于细胞质中．
二.试剂配制:
1.复方联苯胺（Washburn）染液：联苯胺0.3克，95％乙醇99ml，36％亚硝基铁氰化钠1ml，此染液可保存10月或更久．
2.过氧化氢溶液：3％过氧化氢1滴，蒸馏水5ml．此液用时需新鲜配制．三．染色步骤：
1.于新鲜涂片滴加复方联苯胺染液3～8滴，使之盖满涂片．
2.1～2分钟后加入等量过氧化氢溶液．
3.8～10分钟后用水冲洗．
4.在空气中晾干后直接观察，或用瑞氏染液复染后进行观察．瑞氏染液复染时间为20分钟．
四.注意事项：
3％过氧化氢溶液需保证质量．其稀释液必须应用时新鲜配制．
联苯胺具有致癌性，染色时需加注意．
五．临床意义：
1.正常细胞反应：POX主要存在于粒系细胞中，除早期原粒细胞外，晚期原粒细胞及其后各阶段细胞均呈阳性反应，细胞越成熟，其阳性反应越强．原单细胞为阴性反应，幼稚和成熟单核细胞呈弱阳性反应．淋巴细胞系／巨核细胞系／红细胞系各阶段细胞均呈阴性反应．
2.急性白血病类型鉴别：急性粒细胞白血病时，其原幼细胞多呈阳性反应；急性单核细胞白血病时，其原幼细胞多呈弱阳性或阴性反应；急性淋巴细胞／巨核细胞性白血病时，因原幼细胞多呈阴性反应．。
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过氧化物酶(P e r o x i d a s e,P O X)染色
联苯胺法
一.原理:粒细胞及一部分单核细胞胞浆内的颗粒含有过氧化酶.此酶能将过氧化氢中的氧释放出来,而把联苯胺氧化成氧化联苯胺,后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝色颗粒,沉着于细胞质中．
二.试剂配制:
1.复方联苯胺（Washburn）染液：联苯胺0.3克，95％乙醇99ml，36％亚硝基铁氰化钠1ml，此染液可保存10月或更久．
2.过氧化氢溶液：3％过氧化氢1滴，蒸馏水5ml．此液用时需新鲜配制．三．染色步骤：
1.于新鲜涂片滴加复方联苯胺染液3～8滴，使之盖满涂片．
2.1～2分钟后加入等量过氧化氢溶液．
3.8～10分钟后用水冲洗．
4.在空气中晾干后直接观察，或用瑞氏染液复染后进行观察．瑞氏染液复染时间为20分钟．
四.注意事项：
3％过氧化氢溶液需保证质量．其稀释液必须应用时新鲜配制．
联苯胺具有致癌性，染色时需加注意．
五．临床意义：
1.正常细胞反应：POX主要存在于粒系细胞中，除早期原粒细胞外，晚期原粒细胞及其后各阶段细胞均呈阳性反应，细胞越成熟，其阳性反应越强．原单细胞为阴性反应，幼稚和成熟单核细胞呈弱阳性反应．淋巴细胞系／巨核细胞系／红细胞系各阶段细胞均呈阴性反应．
2.急性白血病类型鉴别：急性粒细胞白血病时，其原幼细胞多呈阳性反应；急性单核细胞白血病时，其原幼细胞多呈弱阳性或阴性反应；急性淋巴细胞／巨核细胞性白血病时，因原幼细胞多呈阴性反应．。