过氧化物酶染色液(氧化WG-KI法) 使用说明

过氧化物酶染色Washburn法1.实验原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

2.标本采集2.1病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。

凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。

2.2标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液2.3标本采集要求2.3.1高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

2.3.2临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

3.标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。

4.标本运输：室温运输5.标本拒收的标准：溶血、稀释标本不能作测定。

6.试剂6.1试剂名称：血细胞pox染色试剂6.2试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司6.3试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂3：95％乙醇，室温避光保存。

试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。

7.操作步骤7.1新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后室温放置5分钟，流水冲洗。

7.2滴加95％乙醇脱色，水洗后瑞氏染色，复染后镜检观察结果。

8.结果判断8.1阳性—细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质，定位于胞质。

8.2阴性—细胞内无棕黄色或蓝黑色颗粒。

9.临床意义9.1粒细胞系统呈集中状粗颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

网状细胞及吞噬细胞有不同程度的阳性。

9.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

10.操作性能：快速简便，特异性强，灵敏度高。

GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS80035.1.2 v.A GENMED髓性过氧化酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED髓性过氧化酶活性染色试剂是一种旨在使用对苯二胺作为指示剂，分析血液和骨髓细胞样本中过氧化酶表达，所呈现棕黑色沉淀现象的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心改良、成功实验证明的。

主要适用于血液和骨髓细胞的酶活性检测。

尤其可用于血液学研究和白细胞病理分型鉴定。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景人体髓性过氧化酶（myeloperoxidase；MPO），又称粒细胞过氧化酶（leukocyte peroxidase），主要存在于人体中性颗粒细胞（neutrophil granulocyte）中嗜天青颗粒|（azurophilic granule）里和单核细胞（monocyte）的溶酶体里。

在白血病中，急性淋巴细胞性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia；ALL）的标志之一是髓性过氧化酶活性阴性，以此与急性骨髓性白血病（Acute Myelogenous Leukemia；AML）区别，尤其M3型的髓性过氧化酶活性100％阳性。

髓性过氧化酶活性染色方法包括联苯胺（benzidine）、二氨基联苯胺（diaminobenzidine）以及对苯二胺（p-phenylenediamine）等作为指示剂，但前二者为致癌剂。

对苯二胺与邻苯二酚，在髓性过氧化酶的催化下，发生氧化偶联反应，而产生不溶性棕黑色共聚物，用于检测髓性过氧化酶的活性。

其对苯二胺染色反应原理是：髓性过氧化酶p-phenylenediamine ＋ pyrocatechol ＋H2O2→棕黑色不溶性产物产品内容GENMED清理液（Reagent A）毫升GENMED固着液（Reagent B）毫升GENMED染色液（Reagent C）毫升GENMED反应液（Reagent D）微升产品说明书1份保存方式保存GENMED染色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备苏木素复染试剂盒（GMS80067）：用于常规染色后复染1.5毫升离心管：用于配制染色工作液的容器小型染色缸：用于染色操作光学显微镜：用于细胞染色后观察分析实验步骤实验开始前，将试剂盒里的GENMED染色液（Reagent C）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。

医院检验中心过氧化物酶(POX)染色操作规程[原理]粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。

受体被氧化成联苯胺蓝。

再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。

[试剂]1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。

贮于棕色瓶中，可保存数月。

工作时应小心溶液污染皮肤。

2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。

[操作](1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2分钟。

(2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。

(3)涂片用流水冲洗。

待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。

[结果观察]可报告阳性程度或阳性细胞％。

阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。

弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。

阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。

相当于(++)。

强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。

相当于(+++）。

[临床意义](1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含有不同程度的蓝色颗粒。

嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。

嗜碱性细胞为阴性。

(2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。

(3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。

(4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。

(5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的关键化学染色。

FAB分型规定前者阳性率＜3％。

[附注](1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。

(2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热助溶后应用。

(3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。

双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。

涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。

氧化亚甲蓝-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用陈万新;樊丽华;胡间石;刘军【期刊名称】《临床血液学杂志》【年(卷),期】2006(19)2【摘要】目的:介绍一种安全稳定、快速可靠的髓过氧化物酶(MPO)染色新方法(氧化MB-KI法)。

方法:采用亚甲蓝(Methylene blue)为显色剂取代Pereira原法中的Leishman's染料,并采用人工预先氧化亚甲蓝溶液的新方法,使其一步到位达到最佳氧化成熟程度,以后每次配制MPO染色工作液时不必加H2O2。

结果:本法(氧化MB-KI法)MPO阳性产物呈棕黑色颗粒状,细胞核为蓝绿色。

与Washburn联苯胺法比较,两者阳性率十分相近,差异无显著性意义(P>0.05)。

结论:氧化MB-KI 法所显示的MPO阳性反应对比鲜明、易于判断,避免了假阴性结果的发生。

试剂安全、稳定可靠、易于配制、操作简单、染色时间短,是理想的MPO染色方法。

【总页数】3页(P107-109)【关键词】髓过氧化物酶类;细胞化学;碘化钾;亚甲蓝【作者】陈万新;樊丽华;胡间石;刘军【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所【正文语种】中文【中图分类】Q55【相关文献】1.氧化Wright-Giemsa-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用 [J], 陈万新;丁飞;李毅;刘军;樊丽华2.血细胞髓过氧化物酶染色--吡啰红G-过氧化氢-碘化钾法及其应用 [J], 陈万新;吴健民3.吡啰红B-过氧化氢-碘化钾法髓过氧化物酶快速染色及应用 [J], 陈万新;吴健民4.4种碘化钾-过氧化氢法髓过氧化物酶染色结果比较 [J], 陈万新;朱红琳;薛梅;官阳5.氧化吡啰红G-碘化钾法在血细胞髓过氧化物酶快速染色中的应用 [J], 陈万新;吴健民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

过氧化物酶染色标准操作程序1.检验目的通过对血细胞内过氧化物酶的染色测定，可用于白血病细胞的鉴别与分型。

2.检测原理血细胞内过氧化物酶（POX）能将无色的二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，使前者变为有色染料沉积在细胞质酶所在部位。

1.标本新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。

2.试剂联苯胺液(A液)、H2O2(B液) 、瑞姬氏染液(C液) 、磷酸盐缓冲液(D液) 3.环境和安全5.1环境温度要求：2~8℃保存,有效期12个月。

5.2安全控制：工作中所有与病人的样本接触或有潜在性接触可能的样本都视为污染物。

在操作时有必要穿戴保护性的工作服、外套和手套。

在处理废弃样本时不可触摸废弃物，一定戴手套和护目镜以避免直接接触。

如果操作人员不小心接触血液、试剂、废弃物/皮肤或衣物上沾到了样本、试剂及废液，用大量清水冲洗并适当考虑必要的医疗措施。

4.操作步骤6.1新鲜的涂片滴加A染色液数滴(以覆盖涂片为宜),再滴加B染色液数滴(A 液:B液=1:1),混合后室温染色5~10分钟,流水冲洗2分钟，待干。

6.2然后用瑞姬氏染色(C液)与磷酸盐缓冲液(D液)1:2比例混合，对其染色3~5分钟,流水冲洗,干后镜检。

7.检验结果解释阴性------胞质内无沉淀物（无色）阳性------胞质内出现棕黄或蓝黑色沉淀物8.实验室临床解释8.1粒细胞系统呈集中状颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

8.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

8.3在白血病细胞的鉴别与分型中的应用：强阳性提示：FAB中的M1，M2，M3；部分强阳性与弥散状弱阳性提示：FAB中的M4；弥散状弱阳性提示：FAB中的M5；阴性提示：FAB中的M0，M5，M6，M7，ALL等。

9.变异潜在来源若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。

宜可使用某些抗凝血（肝素、EDTA），样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物酶被抑制或破坏。

过氧化物酶显色
过氧化物酶显色是一种常见的生物学实验技术，它利用过氧化物酶催
化底物产生颜色反应，从而实现对样品中过氧化物酶活性的定量分析。

下面，我将从原理、实验步骤、应用等方面介绍这种技术。

一、原理
过氧化物酶显色技术的主要原理是利用底物发生氧化还原反应，从而
产生可见光吸收，实现对过氧化物酶活性的定量分析。

过氧化物酶催
化底物如TMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）在存在过氧化氢（H2O2）的情况下，底物发生氧化反应，生成过氧化物，过氧化物再将底物氧化产生高分子产物，在酸性环境中产生深蓝色或棕色沉淀，
可通过比色法分析结果。

二、实验步骤
1. 准备样品：将待测样品加入显色液中，显色液的具体组成根据样品
的性质而定。

注意：样品中不要含有过氧化氢，否则会干扰结果。

2. 添加底物：加入TMB底物。

3. 加入过氧化氢：加入H2O2。

4. 活化催化剂：等待5-10分钟，让催化剂活化。

5. 加入停止液：加入酸性停止液，停止反应。

6. 分析结果：通过分析样品颜色深浅或光密度值，计算出样品中过氧化物酶的活性。

三、应用
过氧化物酶显色技术被广泛应用于各种生物学、医学领域中。

例如，利用过氧化物酶显色技术可以进行酶动力学研究、检测样品中过氧化物酶的活性、检测生物体内一氧化氮的浓度等。

此外，它还可以应用于药物筛选、抗氧化剂研究等。

总之，过氧化物酶显色技术具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点，是一种常用的生物学实验技术。

它的应用领域广泛，对于生物学和医学领域的研究和工作有着重要的意义。

过氧化物酶（微量法）试剂盒使用说明货号:BC0095规格:100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体×1瓶，4℃保存；用时每瓶加入3mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。

试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存。

产品简介：POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

POD 催化H 2O 2氧化特定底物，在470nm 有特征光吸收。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3秒，间隔10秒。

重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、POD 测定操作表1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。

2、测定前将试剂一、二和三在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min 以上。

3、样本测定表试剂名称测定孔（μL）样本10蒸馏水60试剂一120试剂二30试剂三30在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。

计算ΔA=A2-A1。

注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）放置10min以上，测定时加入240μL混合液和10μL样本测定。

花粉活力染色液(过氧化物酶法)简介：花粉活力的大小直接影响授粉、受精过程，与植物的产量密切相关，通过花粉活力的测定，可了解花粉的可育行，并掌握不育花粉的形态、生理特征。

花粉中含有过氧化物酶，活力高的花粉过氧化物酶活性也高。

过氧化物酶与氧化剂(如过氧化氢等)形成一种复合物，这种复合物中的过氧化氢被活化，从而能氧化酚类化合物，根据颜色变化可判断花粉的活力。

该染色液仅用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、配制氧化剂工作液：取适量的氧化剂，按氧化剂：蒸馏水的比例混合，即得氧化剂工作液。

室温保存，1个月有效。

注意：氧化剂有腐蚀性，小心操作。

2、取成熟将要开放的新鲜花朵，小心去除花瓣和雌蕊。

3、将花粉物质置于干净的载玻片上，分别滴加芳香胺显色液、氧化剂工作液各1滴，混匀，盖上盖玻片。

4、30℃恒温箱孵育。

5、低倍显微镜下观察，每片取5个视野。

染色结果：活力强紫红色 活力弱淡红色 无活力或不育无色计算：观察统计100粒花粉，计算有活力花粉的百分数。

其公式为：花粉活力百分数(%)=有活力花粉数/100×100%考前须知： 编号 名称 DP0108 Storage 试剂(A): 芳香胺显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(B): 氧化剂 2×1ml RT 使用说明书 1份1、染完色后，应立即显微镜下观察。

2、氧化剂有腐蚀性，小心操作，防止氧化剂挥发，否那么染色力会下降。

3、染色时需要将花粉完全浸没于染色液中。

4、为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：编号名称DC0032 Masson三色染色液DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)TC1169 尿尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。

过氧化物酶染色作业指导书一、原理血细胞内的过氧化物酶分解H2O2，释出初生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后进一步变成棕黑色化合物，沉着于胞浆内。

二、试剂1、联苯胺染液：联苯胺0.3g ，碱性品红0.3g ，95%乙醇100ml待完全溶解后与亚硝基铁氰化钠饱和水溶液（0.121mol/L）1ml混匀后，置棕色瓶内可室温保存8-10个月。

2、过氧化氢溶液：3%过氧化氢溶液0.3ml ，蒸馏水25ml 此液临用前新鲜配制3、脱色液：95%乙醇4、复染液：瑞氏染液三、操作步骤1、用常法制备骨髓（血）涂片，待干。

2、在新鲜涂片上滴加联苯胺溶液数滴，以覆盖骨髓（血）膜为适，染1min。

3、滴加等量新鲜配制的过氧化氢溶液，轻轻摇动玻片或用洗耳球轻吹液面，使之混匀染色4-5分钟。

4、用流水冲洗1分钟左右。

5、用95%乙醇脱色，脱至红色退尽为止，水洗，待干。

6、用瑞氏染液复染15-20分钟。

7、水洗，待干，镜检。

四、临床意义1、急性粒细胞白血病时，白血病性原始粒细胞可呈阳性反应，阳性颗粒一般较多较粗大，常呈局限性分布；急性淋巴细胞性白血病时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞均呈阴性反应；急性单核细胞白血病时，白血病性原始单核细胞呈阴性反应，有时虽有少数可呈弱阳性反应，但阳性颗粒少而细小，常弥散分布。

2、小型原始粒细胞和原始淋巴细胞不易区别，如果小型原始细胞呈过氧化物酶阳性反应，可确定为小型原始粒细胞。

3、急性早幼粒细胞白血病有时须与急性单核细胞白血病鉴别，如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性反应，应确定为急性早幼粒细胞白血病。

4、成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化：（1）、活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染（特别是化脓菌感染）、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。

（2）、活性减低：可见于急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、骨髓增生异常综合症、放射病及退化性中性粒细胞。

苏丹黑B（Sudan black B，SB）是一种脂溶性染剂，可溶解于细胞浆内的含脂结构中，使胞质中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒。