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一种快捷有效的构建cDNA文库的方法徐远峰;黄文峰;高艳梅;翟金玲;黄惜【期刊名称】《贵州科学》【年(卷),期】2009(027)003【摘要】构建cDNA文库是研究基因组功能基因一种有效的手段,传统的建库方法通常需要在双链cDNA两端分别加上带限制性酶切住点的接头序列,通过酶切使之产生与质粒匹配的粘性未端,然后与质粒连接构成文库.本文介绍一种简单而且不需要核酸内切酶的构建cDNA文库的方法.该方法的主要步骤包括:(1)通过反转录合成cDNA第一条链,通过置换底物的方式ceDNA 3'末端合成接头序列.(2)利用cDNA两端的接头引物,通过Taq DNA合成酶PCR扩增合成cDNA第二条链.(3)将PCR产生的双链cDNA直接与T-载体连接.(4)将连接物转化大肠杆菌,得到cDNA文库.利用本方法,我们成功构建红树植物红海榄的cDNA文库.PCR结果显示插入的片段分布在0.5～3.0 kb之间,大部分cDNA的长度在500～1000bp之间,表明cDNA具有较好的完整性.本方法具有操作简单、高效率、低成本、RNA 模板需要量少的特点,而且适用于任何高等生物RNA样品.【总页数】5页(P71-75)【作者】徐远峰;黄文峰;高艳梅;翟金玲;黄惜【作者单位】海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228;中国热带农业科学院橡胶栽培研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228;海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228;海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228【正文语种】中文【中图分类】O641.3【相关文献】1.一种构建全长cDNA文库的方法 [J], 刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨2.一种改进的小非编码RNA cDNA文库构建方法 [J], 杜光石;罗发涛;肖燕;陈红军;吴传芳3.一种构建 cDNA 文库时 Sepharose CL-4B 筛分 cDNA 的简化方法 [J], 汪洛;张迺蘅4.一种简单快速的cDNA文库构建方法 [J], 赵艳景;胡亚楠;王颖;刘睿;叶波平;王旻;吴梧桐5.一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法 [J], 董志敏;李英慧;张宝石;关荣霞;常汝镇;邱丽娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RNA Extraction Protocol1.实验原理异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织1. 样品裂解2. 分离总RNA2.实验试剂与器材2.1实验试剂RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。
2.2实验器材微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。
3.实验前准备工作实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。
提前20min打开低温离心机预冷。
准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。
4.实验步骤4.1取样（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************1红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.22无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)4黄色/紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。
USuperRT cDNA KitSuperRT cDNA 第一链合成试剂盒Cat. No.WD3126保存：-20℃组分说明产品简介本产品包含从RNA 模板逆转录成cDNA 第一链所需的所有试剂，其中包括高效逆转录酶、反应缓冲液、引物、dNTP等。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更易获得全长的cDNA。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA。
适用于第一链cDNA 的合成、RT-PCR、Real-Time PCR 以及全长cDNA 文库的构建等。
注意事项1.在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并高压灭菌30分钟后使用。
2.本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
3.若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。
本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购.使用方法注意：1 ng-5 µg总RNA可建立20 µl反应体系，如果总RNA量大于5 µg，请按比例扩大反应体系。
ⅰ逆转录操作步骤：1.将RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。
2.根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。
注意：若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）本试剂盒并未提供，。
CDNA合成的基本原理介绍CDNA合成是一种常用的分子生物学技术，用于将RNA转录本转化为相应的DNA序列。
本文将详细探讨CDNA合成的基本原理及其在生物研究中的应用。
一、CDNA合成的步骤CDNA合成通常包括以下几个主要步骤：1. RNA提取首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
RNA提取的方法有很多种，常用的包括酚-氯仿法和商用RNA提取试剂盒。
2. 反转录反应反转录反应是将RNA转录本转化为相应的DNA序列的关键步骤。
该反应通常在逆转录酶的作用下进行。
逆转录酶能够将RNA模板上的核酸序列转录成互补的DNA链。
3. DNA合成在反转录反应中，逆转录酶合成的第一链cDNA是由RNA模板的互补链合成的。
为了合成双链cDNA，需要在反应体系中加入DNA聚合酶和dNTPs。
4. 纯化和放大合成的cDNA需要经过纯化和放大，以获得足够的量用于后续实验。
纯化通常通过凝胶电泳、酶切和PCR等方法进行。
二、CDNA合成的重要考虑因素在进行CDNA合成时，需要考虑以下几个重要因素：1. RNA模板的选择在CDNA合成之前，需要选择适当的RNA模板。
RNA模板的选择应根据研究的目的和样本的特性来确定。
不同类型的RNA模板可能需要不同的反转录酶和反应条件。
2. 反转录酶的选择逆转录酶是CDNA合成的关键酶，不同的逆转录酶具有不同的特性。
例如，一些逆转录酶具有RNA依赖性DNA聚合酶活性，可以直接合成双链cDNA，而其他逆转录酶则需要额外添加DNA聚合酶。
3. 反应条件的优化反转录反应的条件需要根据具体实验进行优化。
反应温度、反应时间、逆转录酶和dNTPs的浓度等因素都可能影响CDNA合成的效率和准确性。
4. RNA降解的控制RNA在提取和合成过程中容易受到降解的影响。
为了避免RNA降解对CDNA合成的影响，可以在提取过程中添加RNase抑制剂，并在合成过程中加入RNase H来降解RNA模板。
三、CDNA合成的应用CDNA合成在生物研究中有广泛的应用，包括以下几个方面：1. 基因表达分析CDNA合成可以用于基因表达分析。
产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
cDNA合成1. cDNA第一链的合成1.1 取一个0.2 ml 薄壁管，于冰浴上加入：混匀，短暂离心收集液滴至管底。
1.2 72°C温育2分钟后，冰浴2分钟并短暂离心收集液滴至管底。
1.3 在管中冰浴按下列顺序加入：混合后离心5 秒钟，置冰上备用。
1.4 GeneAmp 2400 PCR仪上42°C温育1小时。
注：若使用水浴进行温育，应在反应混合物上覆盖一滴石蜡油以防止水分蒸发。
1.5 取出管子置于冰浴上中止反应。
若不进行下一步，则将产物冻存于-20°C。
2. LD PCR扩增cDNA双链2.1于冰浴上在0.2ml薄壁管中加入：混匀后，短暂离心收集液滴至管底。
根据表1的数据确定PCR循环数。
2.2 GeneAmp 2400 PCR仪上进行PCR反应，参数为：· 95°C 1min· 22次循环：95°C 15sec68°C 5min3. 双链cDNA补平反应3.1 每50μl扩增好的双链cDNA加2μl浓度为20μg/μl的蛋白酶K，混匀后45°C温育1小时，短暂离心后置于90°C，10分钟以灭活蛋白酶K。
3.2 将离心管冰浴2分钟，加入3μl（15 units）T4 DNA聚合酶，16°C反应30分钟。
3.3 72°C，10分钟灭活酶，加入27.5μl，4 mol/L醋酸铵，再加入210 μl 95％的乙醇，颠倒管子数次混匀溶液。
3.4 立即于室温，14,000 rpm条件下离心20分钟（离心前不要将管子置于冰浴，否则会有杂质的共沉淀）。
小心弃上清，用80％乙醇洗涤沉淀一次。
3.5 室温干燥沉淀，用19μl水重溶。
4. 接头与cDNA的连接4.1 在3中第5步得到的重悬液中加入：混匀后，短暂离心收集液滴至管底。
16°C连接过夜。
4.2 加入3μl，0.2mol/L EDTA中止反应。
cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。
（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。
2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。
94℃预变性 2.5min 。
进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。
最后 72℃延伸 7min。
注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。
cdna第一链合成所需要的引物CDNA合成是一种在实验室中合成DNA的技术。
在合成CDNA的过程中，引物起着关键的作用。
引物是一种短链DNA或RNA序列，其序列与目标RNA 的反义序列互补。
通过引物的互补配对，CDNA链可以在反转录过程中产生。
在合成CDNA第一链时，需要使用两种引物，即逆转录引物和OLIGO（dT）引物。
逆转录引物是在典型的CDNA合成反应中使用的第一个引物，它通常由RNA 依赖的DNA聚合酶（例如M-MLV逆转录酶）合成。
逆转录引物的设计应囊括目标RNA的起始位点，以确保所有目标RNA分子都能够转录成CDNA。
OLIGO（dT）引物是用于合成mRNA的CDNA的第二个引物。
它是一种具有多个连续脱氧胸腺嘧啶（dT）的短链DNA序列。
这种引物通过与目标mRNA 的多聚腺嘌呤尾部互补，从而将其用作合成CDNA的起始点。
在实际实验中，通常会使用反转录引物和OlIGO（dT）引物的混合物来合成CDNA的第一链。
这是因为许多mRNA分子的5'端没有腺嘌呤残基，所以OLIGO（dT）引物无法与它们互补。
因此，在使用OLIGO（dT）引物无法反转录mRNA分子的情况下，反转录引物可以用于产生CDNA的第一链。
此外，在CDNA合成的过程中，还需要引物包含其他特定序列，以便于在后续实验中对CDNA进行扩增、检测等操作。
例如，引物的末端通常含有限制酶切位点，以便将CDNA放入载体中。
此外，引物还可以带有一组序列标签，如荧光标签或亲和标签，以便实现CDNA的可视化或纯化。
总结起来，合成CDNA第一链所需的引物包括逆转录引物和OLIGO（dT）引物，它们的序列应与目标RNA互补。
合成CDNA的引物设计应考虑目标RNA的特点，并可能包含特定的序列标签或限制酶切位点。
引物的选择及其设计对于成功合成CDNA的第一链至关重要，因此需要进行仔细的序列分析和合成策略的考虑。
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•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit是一套用于以RNA为模板高效合成第一链cDNA的完整系统，可合成长达13kb 的cDNA。
试剂盒配套提供的RiboLockRNase Inhibitor，可有效防止RNA模板的降解。
试剂盒配套提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物。
oligo(dT)18引物可以选择性地与mRNA中的poly (A)尾结合。
随机六聚体引物无需poly (A)尾，因此可转录mRNA 5’-端区域，也可以无poly
(A)尾的RNA (如micoRNA)为模板合成cDNA。
该试剂盒也可使用基因
特异性引物。
•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明优点：
•合成全长的第一链cDNA，最长可合成13kb的cDNA
•最佳反应温度为42℃
•完全一提供RT反应所需的所有组分
•应用:
•第一链cDNA合成，作为RT-PCR和实时RT-qPCR的模板
•构建全长cDNA文库
•反义RNA合成
•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成全长cDNA
• 1 μg小鼠心脏总RNA作为模板，用oligo(dT)18 引物进行逆转录反应。
由此合成的cDNA，再作为Taq DNA Polymerase后续PCR扩增的模板。
末端2024 bp片段的成功扩增，表明长度为13.8 kb的全长RN***段得到成功的逆转录。
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