通用反转录试剂盒(M-MLV)使用说明

Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。

是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。

二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。

细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。

takara反转录试剂盒说明书Takara反转录试剂盒是一种用于研究RNA分子的试剂盒。

该试剂盒可以用于DNA的反转录，将RNA转录成DNA，并进行后续的PCR扩增。

反转录试剂盒在生命科学领域中起着非常重要的作用，因此在使用过程中需仔细阅读说明书并按照说明书进行操作。

一、试剂盒组成Takara反转录试剂盒主要包含以下拉玛：1.反转录酶：外源的M-MLV反转录酶，具有高度的反转录活性和优异的扩增效率等优良特性。

2.反转录缓冲液：针对反转录酶的酶切优化反转录缓冲液。

3.引物：随机9mers引物，适用于多种RNA逆转录的应用。

4.对照RNA：In Vitro转录的任意序列的RNA，用于反转录和后续PCR扩增反应的质控。

二、试剂盒使用方法1. RNA提取：在使用Takara反转录试剂盒之前，需要从样品中提取RNA。

2. 反转录反应：将RNA测序专用随机引物、针对反转录酶的反转录缓冲液、反转录酶和RNA样品混合，进行逆转录反应。

3. PCR扩增：反转录完成后，可以利用PCR扩增技术对转录所得DNA进行扩增，完成DNA序列的检测和分析。

三、试剂盒注意事项1. 避免多次冻融。

为保证试剂的稳定性，反转录试剂盒必须储存于-20℃及以下的冰箱中，避免多次冻融。

2. 操作时需佩戴手套。

操作时需佩戴手套，尽量避免手汗或皮脂的污染，影响试剂盒的效率和准确性。

3. 注意反转录缓冲液的稀释量。

反转录缓冲液的稀释量会影响反转录效果，因此需要按照说明书进行操作，精准稀释。

4. 注意反转录酶的用量。

不同反转录酶的最优用量不同，需要根据实验需要按照说明书或文献进行调整。

5. 确认对照RNA引物的扩增效果。

在进行PCR扩增前，需要先进行对照RNA引物的扩增，以确认反转录反应的正确性，避免因为反应偏差而引起的实验结果的偏差。

4. 根据实验需要进行调整。

反转录试剂盒虽然具有大量的优良特性，但是实验环境和实验条件的不同，会对反转录试剂盒的效果产生较大的影响，因此需要根据实验需要进行调整。

Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。

为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。

但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。

在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。

而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。

Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。

同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。

使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。

通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。

用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。

一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。

由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。

规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。

试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。

PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。

结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。

保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。

注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。

2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。

3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。

4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。

5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。

6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。

生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。

产品目录号：M1701 M1705M-MLV 反转录酶简明操作步骤注意：这是节选操作步骤，详细英文说明书见 /tbs/9pim170/9pim170.html 本简明操作步骤电子版见cDNA 第一链合成操作步骤：请使用者准备：z 重组RNasin®核酸酶抑制剂 (目录号N2511) z dATP ,10mM(目录号U1201,100mM) z dCTP ,10mM(目录号U1221,100mM) z dGTP , 10mM(目录号U1211,100mM) z dTTP , 10mM(目录号U1231,100mM) z 无核酸酶的水(目录号P1193)1． 在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：RNA2ug引物 1ug 无核酸酶水补齐至 15ul加热离心管到70℃，5分钟，这样可以打开模板的二级结构。

然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构。

短暂离心，使溶液归于管底。

2. 按以下顺序在复性的引物/模板管(即以上小离心管)中加入下列组分：注意：不要改变引物与mRNA 的比例。

M-MLV 5XReaction Buffer 5ul dATP ,10mM 1.25ul dCTP ,10mM 1.25ul dGTP , 10mM 1.25ul dTTP , 10mM 1.25ul 重组RNasin®核酸酶抑制剂 25units M-MLV 反转录酶 200units 加无核酸酶水补齐至 25ul3. 轻弹离心管混合溶液。

若使用随机引物，在37℃孵育60分钟进行反转录反应；若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特异引物)，则在42℃孵育60分钟进行反应。

4. 第二条链合成可使用您选择的操作方法，也可参考: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.注意：M-MLV 反转录酶缓存液与许多下游应用相容。

M-MLV逆转录酶说明书【货号】【规格】C28025-01110,000 单位C28025-014 50,000 单位C28025-021 200,000 单位浓度：200U/µl 保存于-20℃（勿除霜）【描述】莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV RT）能以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链。

本逆转录酶是M-MLV的部分pol基因在大肠杆菌中的表达产物（1-3）。

使用M-MLV RT 可以合成长达7kb的第一链cDNA。

【组分】M-MLV逆转录酶5×第一链合成缓冲液[250mM Tris-HCl（pH8.3，室温），375 mM KCl，15mM MgCl2]0.1M DTT【保存缓冲液】20mM Tris-HCl（pH7.5），100mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.01%（v/v）NP-40，50%（v/v）甘油【保存条件】将所有的组分保存于-20℃冰箱（勿除霜）。

【额外的组分】仅在使用前将5×第一链合成缓冲液和0.1M DTT在室温解冻，用完后迅速重新冰冻。

RNaseOUT™重组核酸酶抑制剂（40单位/μl）可从Invitrogen单独订购（货号：10777-019）。

【使用M-MLV逆转录酶进行第一链cDNA的合成】建立20μl 的反应体系可以用于逆转录1ng～5μg总RNA或1～500ng mRNA1．将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中1μl oligo(dT)12-18(500μg/ml)，或50–250ng随机引物或2pmole基因特异性引物1ng-5μg总RNA或1ng-500ng mRNA1μl 10mM dNTP混合物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP均为10mM，pH中性）加入灭菌蒸馏水至12μl2．混合物在65℃加热5分钟后，迅速置于冰上冷却。

短暂离心后，加入以下组分：4μl 5×第一链合成缓冲液2μl 0.1M DTT1μl RNaseOUT™核酸酶抑制剂（40单位/μl）（注意：如果起始RNA的量小于50ng，则必须加入RNaseOUT™）3．在离心管中轻轻将各种成分混合，并在37℃下孵育2分钟。

反转录实验步骤总结反转录(Reverse transcription，RT)是指将RNA模板拷贝成cDNA的过程。

通过RT反向转录法，可以将RNA转化为cDNA，使其能够被用于分子生物学上的后续实验，如聚合酶链反应(PCR)、基因克隆和测序等。

下面是一个常用的RT反转录实验的步骤总结。

1.准备实验材料和试剂进行RT反转录实验前，首先需要准备所需的实验材料和试剂。

主要包括：- RNase-free水：用于稀释试剂和配制反应体系。

- 反转录酶(Reverse Transcriptase)：常用的反转录酶有M-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶等。

-异核核苷酸(dNTPs)混合物：包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP等四种异构体，用于合成cDNA。

- 引物(Primers)：引物是用于引导反转录反应的启动子序列。

需要根据所研究的目标基因选择合适的引物。

- Buffer和酶切液：反转录酶通常有其特定的缓冲液和辅助酶切液。

- RNase抑制剂：用于抑制RNase的酶活性，保护RNA不被降解。

2.提取RNA小样本RNAs可采用琼脂糖凝胶电泳分离法，大样本可采用RNA提取试剂盒提取等方法来提取RNA。

提取RNA时需注意RNase的污染问题，保持所有操作环境和用具的洁净，最好在RNase-free条件下进行。

3.定量和纯化RNA使用纳光仪或比色计对提取的RNA进行浓度测定。

通常要求RNA质量240~260 nm的波长比为1.8~2.0，以确保RNA的纯度。

可以采用RNase-free纯化试剂盒对纯化的RNA进行处理，去除污染物质和DNase酶。

4.设计引物基于目标基因的序列特点，选择合适的引物进行设计。

引物的长度通常在18-24个核苷酸之间，GC含量控制在40-60%最佳。

引物首先设计一个很短的全补或部分补序列，需要引导反转录发生。

反转录后，对cDNA合成的目标区域进行PCR扩增。

5.反转录反应用得到的RNA进行反转录反应。

通用反转录试剂盒(M-MLV)使用说明货号：RP1105规格：50T/100T保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为1年。

产品内容：试剂盒组成50次100次M-MLV(200U/μL)50μL50μL×25×M-MLV Buffer200μL400μL(10uM)100μL200μLOligo(dT)16RNasin(40U/μL)25μL50μLdNTPs(10mM)50μL100μLO1mL1mL×2RNase-free ddH2说明书1份1份产品简介：通用反转录试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应。

它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物用于后续的PCR扩增和分子克隆实验。

通用反转录试剂盒中配置的酶为进口的酶。

RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。

通用反转录试剂盒可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

操作步骤：一、反转录反应1、在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分：1-5μg总RNA或50-500ng mRNA2μL Oligo(dT)或2pmole基因特异性引物16O至14.5μL补RNase-free ddH22、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：4μL5×M-MLV Buffer1μL dNTPs0.5μL RNasin1μL M-MLV3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。

4、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。

5、若用于后续PCR扩增,用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL，取2-5μL作为PCR 反应模板。

注意事项：1、用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。

使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上转录反应步骤和孵育1.解冻冷冻的试剂把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。

vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把2×NTP/CAP 放在冰上，10×reaction buffer保存在室温，所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。

2.室温下转录反应如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀，离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。

以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。

当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系(用0.1-0.2ug PCR产物模板或0-1ug线性质粒模板）对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。

当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。

为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。

下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。

（对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。

对于SP6，为20mM.）应该添加多少额外的GTP?对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。

添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。

加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。

RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。

RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。

高压后烤干备用。

如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。

2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。

3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。

三．试剂配制1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。

2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。

3．异丙醇：放入棕色瓶中。

4．氯仿：放入棕色瓶中。

5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。

使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。

Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。

为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。

但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。

在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。

而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。

Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。

同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。

使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。

GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS12073 v.A GENMED超白金M-MLV逆转录酶产品说明书（中文版）主要用途GENMED超白金M-MLV逆转录酶是一种旨在方便、快速地进行各种含有较多RNA二级结构的RNA模板、长片断RNA、微量RNA、反应温度较高的cDNA合成的重要催化反应分子。

广泛运用在RNA片段长达12kb的cDNA 第一链合成、逆转录PCR（RT-PCR）、微型RNA（miRNA）扩增、RNA测序等技术操作。

产品即到即用，无核酶污染，性能稳定，高温度、灵敏度、特异性、稳定性优势明显，扩增产量高，效果堪称同类产品最佳。

技术背景GENMED超白金M-MLV逆转录酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶。

通过将大肠杆菌（E. coli）里近似同源于莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）的pol基因修饰后，分离纯化而得到的。

其带有RNase H的点突变，没有RNase活性，增强热稳定性。

GENMED超白金M-MLV逆转录酶的单位定义为在37℃条件下，10分钟内能够催化1nM dTTP，模板为poly（A）oligo（dT）25，形成酸性不溶性物质所需的酶量作为一个活性单位。

单位活性测试条件是：50mM Tris－HCl （pH8.3），40mM KCl，7mM MgCl2，10 mM DTT，0.1mg/ml BSA，0.5mM [3H]dTTP，0.025mM oligo（dT），0.25mM poly（A），0.01％Nonidet P－40。

GENMED超白金M-MLV逆转录酶的储存缓冲成分包括50％甘油，20mM Tris－HCl（pH7.5），0.1mM EDTA，1 mM DTT，200mM NaCl，0.01％Nonidet P－40。

产品内容GENMED超白金M-MLV逆转录酶（Reagent A）（200U/微升） 微升 GENMED 5 X 完全缓冲液（Reagent B） 微升 GENMED DEPC 水（Reagent C） 毫升产品说明书 1份保存方式经常使用，保存在－20℃冰箱里；长期储存，保存在－70℃冰箱里；避免反复冻融，有效保证6个月实验提示下列的反应体系为推荐使用，用户可以按照自己的反应体系操作：1．一次反应总量为20微升，其中分为两步：第一步：打开二级结构依次加入下列建议使用的用量到0.5毫升PCR管里：成分容量总量Oligo（dT）18（500纳克/微升）微升纳克或Hexamer（随机引物）（200纳克/微升） 微升纳克或特定引物（100纳克/微升）微升纳克总RNA（1微克/微升）微升微克或mRNA（200纳克/微升）微升纳克GENMED DEPC 水（Reagent C）到总量微升2．混匀，瞬时离心5秒3．放进70℃干式恒温仪，孵育3分钟4．即刻放进冰槽里5．第二步：进行生成反应继续依次加入下列建议使用的用量到上述PCR管里成分容量总量GENMED 5 X 完全缓冲液（Reagent B）微升微升10mM dNTPs 微升RNasin（40单位/微升）微升单位GENMED超白金M-MLV逆转录酶（Reagent A）（200U/微升）微升单位GENMED DEPC 水（Reagent C）到总量微升6．混匀，瞬时离心5秒7．（使用Oligo（dT）18或特定引物）放进42℃干式恒温仪，孵育60分钟（使用Hexamer随机引物）放进37℃干式恒温仪，孵育60分钟8．放进70℃干式恒温仪，孵育15分钟9．直接进行后续第二链合成10．或加入微升GENMED DEPC 水（Reagent C），混匀11．移取微升进行后续PCR扩增或直接注意事项1．本产品为2500酶单位总量2．本产品为RNase H点突变的M－MLV逆转录酶，其性能排序为：RNase H点突变的M－MLV逆转录酶＞RNase H缺失的M－MLV逆转录酶＞RNase H无变化的M－MLV逆转录酶＞AMV（Avian Myeloblastosis Virus）逆转录酶3．RNase H的存在导致降解RNA、限制全长cDNA合成、降低合成产量、降低热稳定性、影响实时分析等。