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反转录说明书

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天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书

天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书

通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。

用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。

一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。

由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。

规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。

试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。

PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。

结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。

保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。

注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。

2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。

3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。

4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。

5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。

6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。

生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。

体外转录试剂盒说明书

体外转录试剂盒说明书

使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上转录反应步骤和孵育1.解冻冷冻的试剂把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。

vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把2×NTP/CAP 放在冰上，10×reaction buffer保存在室温，所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。

2.室温下转录反应如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀，离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。

以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。

当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系(用0.1-0.2ug PCR产物模板或0-1ug线性质粒模板）对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。

当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。

为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。

下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。

（对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。

对于SP6，为20mM.）应该添加多少额外的GTP?对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。

添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。

加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。

RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。

提取组织RNA,反转录,qPCR流程图

提取组织RNA,反转录,qPCR流程图

提取组织RNA,反转录,qPCR流程图⼀、Total RNA的提取：1.取出样本，放⼊灭过菌的研钵中，倒⼊液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，10min左右，研磨充分后加⼊1.5ml的EP管，加⼊1ml Trizol，充分匀浆。

（另⼀种，加⼊trizol会冻起来，就⼀直研磨，直到最后化成液体。

）2.室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中3.加⼊1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移⾄新管；4.加⼊等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min5.弃上清，留沉淀，加⼊1ml的75%⼄醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。

重复三次6.弃上清留沉淀，⾃然风⼲（5~10min），加⼊32ul DEPC处理过的⽔，测OD260/280的值，根据结果调整⾄1µg/µl=1000ng/µl，⽴即进⾏反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。

附：1OD260=40µg/ml⽤样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。

（可⽆）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边⼀条不太明显的5SRNA的条带。

证明RNA完整⽆降解。

⼆、反转录：说明书：10 µl 反应体系可最⼤使⽤500 ng 的Total RNA。

20/1µg（以前⽤的40，下次⽤20）20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix 5×PrimeScript Buffer（for Real Time）：4µlPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1µlOligo dT Primer（50 µM）：1µlRandom 6 mers（100 µM）：1µl总RNA ：1µl(1µg/µl)RNase Free dH2O ：12µl反转录反应条件如下:37℃15 min （反转录反应）85℃5 sec（反转录酶的失活反应）4℃-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测β-actin 50µl体系PCR 反应条件:扩增1 kb 的DNA ⽚段的PCR 反应条件如下：预变性：95℃，3min98℃10 sec.55℃30 sec.（下次60℃，去掉⾮特异性）72℃30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72℃5min.4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。

RACE cDNA反转录说明书

RACE cDNA反转录说明书

RACE cDNA反转录说明书1.准备cDNA合成反应液2.0 ul 5×First-Strand Buffer1.0 ul DTT (20uM)1.0 ul dNTP Mix (10mM)总共体积：4ul2.准备以下试剂：5’-RACE-cDNA: 1.0—2.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A3’-RACE-cDNA: 1.0—3.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer AControl-cDNA: 只需要1ul mouse heart total RNA（1ug/ul）3.加入H2O于上一步反应液至5’-RACE为3.75ul，3’-RACE为4.75ul，然后轻轻吸打混匀。

4.放入PCR仪反应：72℃3min,42℃2min然后14000g离心10s。

5.对于5’-RACE-cDNA的合成，加入1ul SMARTerⅡA oligo至4.75ul。

6.配混合液： 4.0ul Buffer mix from step 10.25ul RNase inhibitor (40U/ul)1.0ul SMARTScribe reverse transcriptase (100U)总体积：5.25ul7.将第6步混合液加入第2步微离心管中，使总体积达到10ul。

用枪轻轻吸打混匀。

8.42℃反应90min，然后70℃反应10min。

9.用Tricine-EDTA buffer稀释反应产物：如果：起始RNA<200ng,加入20ul；起始RNA>200ng,加入100ul；Poly A+ RNA，加入250ul。

10. 将稀释好的cDNA模板保存于-20℃，最长时间达3个月。

东盛生物 RT-PCR Kit（逆转录试剂盒） 说明书

东盛生物 RT-PCR Kit（逆转录试剂盒） 说明书

0.6 μl RNasin , M-MLV ； 按下列条件进行反转录反应 42℃ 温浴 60 min（随即引物 37℃ 温浴 60 min） ； 5 终止反应 70℃ 温浴 5 min 终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃ 保存。 6 用 RNase-free ddH2O 将反应体系稀释到 50 μl ，取 2-5 μl 进行 PCR 扩增反应。
20 次逆转录反应，R1012 可进行 100 次逆转
录反应（20 μl 标准 PCR 反应体系，每次使用 M-MLV 1 μl）。
M-MLV 储存液 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 200 mM NaCl 0.1 mM EDTA 1 mபைடு நூலகம் DTT 0.01% NP-40 50% glycerol 5xfirst-strand buffer 成分 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ℃) 375 mM KCl 15 mM MgCl2 50 mM DTT 保存条件 各组分均-20℃保存，避免反复冻融。
●
在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNase 抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲
液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A，B，C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase，因此尽管使用了这些抑 制剂，也要小心不要从手指上引入 RNase。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------广州东盛生物科技有限公司 电话：020-87791356 传真：020-87791381 网址：

takara反转录试剂盒说明书

takara反转录试剂盒说明书

takara反转录试剂盒说明书说明书一、产品简介takara反转录试剂盒是一种高效、可靠的反转录试剂盒，适用于转录RNA为cDNA的实验操作。

本试剂盒由takara公司制造，经过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。

二、试剂盒组成本试剂盒包含以下组分：1. 反转录酶：高效反转录酶，能在广泛的实验条件下进行反转录反应。

2. 基质：提供反应所需的核酸和其他辅助物质。

3. 标记物：用于标记反转录产物的荧光染料或放射性同位素。

4. 缓冲液：维持试剂盒中酶的活性，调节反应条件的缓冲体系。

5. 控制样品：用于检验试剂盒的反应效果和稳定性。

三、实验操作1. 准备工作在进行实验前，请准备所需的实验仪器和试剂，确保实验环境的清洁和无菌，避免污染对实验结果的影响。

2. RNA提取使用适当的方法提取目标RNA样本，并在提取过程中避免RNA的降解。

3. 反转录反应将提取的RNA样本与反转录试剂盒中的反转录酶、基质和缓冲液按推荐比例混合，并在适当的温度下进行反应。

反应时间根据样本的RNA含量和实验要求确定。

4. 停止反应通过停止反应来终止反转录反应，一般使用热敏感性酶来达到这个目的。

5. 产物处理反转录产物可以直接用于下游实验，如实时定量PCR、聚合酶链式反应等，也可以进行储存和后续处理。

四、实验结果解读根据试剂盒的使用目的和实验设计，对反转录产物进行相应的分析和解读。

常见的分析方法有凝胶电泳、实时定量PCR和测序等。

根据实验结果，可以得到RNA的表达情况、差异表达基因等相关信息。

五、注意事项1. 试剂保存：请按照试剂盒上的说明保存试剂，避免暴露在高温、冻融循环和光照等不利条件下。

2. 操作规范：请按照本说明书中提供的实验操作步骤进行操作，避免实验误差对结果的影响。

3. 质量控制：在每次实验中，请使用合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。

4. 废弃物处理：请将使用过的试剂和实验废弃物按照相关规定进行处理，避免对环境造成污染。

M1701 M1705 M-MLV 反转录酶 简明操作说明

M1701 M1705 M-MLV 反转录酶 简明操作说明

产品目录号：M1701 M1705M-MLV 反转录酶简明操作步骤注意：这是节选操作步骤，详细英文说明书见 /tbs/9pim170/9pim170.html 本简明操作步骤电子版见cDNA 第一链合成操作步骤：请使用者准备：z 重组RNasin®核酸酶抑制剂 (目录号N2511) z dATP ,10mM(目录号U1201,100mM) z dCTP ,10mM(目录号U1221,100mM) z dGTP , 10mM(目录号U1211,100mM) z dTTP , 10mM(目录号U1231,100mM) z 无核酸酶的水(目录号P1193)1． 在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：RNA2ug引物 1ug 无核酸酶水补齐至 15ul加热离心管到70℃，5分钟，这样可以打开模板的二级结构。

然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构。

短暂离心，使溶液归于管底。

2. 按以下顺序在复性的引物/模板管(即以上小离心管)中加入下列组分：注意：不要改变引物与mRNA 的比例。

M-MLV 5XReaction Buffer 5ul dATP ,10mM 1.25ul dCTP ,10mM 1.25ul dGTP , 10mM 1.25ul dTTP , 10mM 1.25ul 重组RNasin®核酸酶抑制剂 25units M-MLV 反转录酶 200units 加无核酸酶水补齐至 25ul3. 轻弹离心管混合溶液。

若使用随机引物，在37℃孵育60分钟进行反转录反应；若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特异引物)，则在42℃孵育60分钟进行反应。

4. 第二条链合成可使用您选择的操作方法，也可参考: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.注意：M-MLV 反转录酶缓存液与许多下游应用相容。

D2639A[1]反转录试剂盒说明书

D2639A[1]反转录试剂盒说明书

2．PCR 反应 ① 按下列组成配制 PCR 反应液，全量 50 μl。
试剂名称 上述 cDNA 溶液 dNTP Mixture（各 2.5 mM） Forward Primer（10 μΜ） Reverse Primer（10 μΜ） 10×LA PCR Buffer II（Mg2＋ Plus） TaKaRa LA Taq®（5 U/μl） dH2O
-2-
④ 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液。 试剂名称
上述模板 RNA/引物变性溶液 5×M-MLV Buffer dNTP Mixture（各 10 mM） RNase Inhibitor（40 U/μl） RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/μl） Total Volume
6. 70℃保温 15 分钟后冰上冷却，得到的 cDNA 溶液可直接用于 2nd-Strand cDNA 的合成或者 PCR 扩增等，PCR 扩增时 cDNA 溶液的使用量建议使用 1 μl～5 μl。
●使用λRNA 进行 RT-PCR 反应的实验例
本实验中使用的λRNA 为带有 Poly(A)的λDNA 的转录产物。本实验中分别扩增了 1 kbp、3 kbp、 5 kbp、8 kbp 和 10 kbp 的目的 DNA 片段。
50 % 0.01 %
●起 源： Purified from an E.coli strain expressing a recombinant enzyme.
●活性定义 以Poly（rA）·Oligo（dT）为模板/引物，在 37℃、10 分钟条件下，掺入 1 nmol的 [3H] dTTP所需
要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。
使用量 7 μl 2 μl

BioRT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明书（一步法）

BioRT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明书（一步法）

b、按以下条件进行PCR反应94℃3m i n94℃30s25-35循环***37℃-65℃**30s72℃****45s-7min72℃5min注：*RT产物可增加至5μl 。

**退火温度根据引物Tm值调整，一般为Tm-5℃。

Control引物退火温度为55℃。

*** 当实验样品RNA特别稀少时，可将循环数增加至40-45循环。

**** 延伸时间根据PCR产物大小确定，一般1kb/min 。

Control引物延伸时间45s。

c、反应结束后，取3-5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。

如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

RNA control反应时，退火温度55度，30个循环，扩增片段大小为500bp。

使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。

PROMEGA逆转录试剂盒说明书

PROMEGA逆转录试剂盒说明书

4. Composition of Buffers and Solutions .........................................................5 5. References ...........................................................................................................5 6. Related Products ................................................................................................5 1. Description
PRINTED IN USA. Revised 3/09
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · Part# TB099
For Laboratory Use. Each system contains sufficient reagents for 100 reactions, processing 1μg of RNA per reaction. Includes:
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1,500u 2,500u 50μg 50μg 5μg 320μl 1.4ml 1.2ml 13ml
Reverse Transcription System

Omega-R6831反转录说明书

Omega-R6831反转录说明书
nciple
The E.Z.N.A.™ MicroElute® Total RNA Kits combine the reversible binding properties of HiBind® matrix, a new silica-based material with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated high salt buffer system allows RNA molecules greater than 200 bases to bind to the matrix. Cells or tissues are first lysed under denaturing conditions that practically inactivate RNases. After add the ethanol, samples are then applied to the HiBind® MicroElute ® columns to which total RNA binds, while cellular debris and other contaminants are effectively washed away. High quality RNA is finally eluted in DEPC-treated sterile water.
Introduction
E.Z.N.A.™ MicroElute® Total RNA Kit provides a rapid and easy method for the isolation of up to 50 ìg of total RNA from small amount of cultured eukaryotic cells, tissues such as laser dissected samples (LDS) or fine needle aspirates (FNA). Normally, up to 5 x 105 eukaryotic cells or 5 mg tissue (amounts depend on the tissue used) can be used in a single experiment. The kit allows single or multiple, simultaneous processing of samples in less than 30 min. There is no need for phenol/chloroform extractions, and time-consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation, and precipitation with isopropanol or LiCl, are eliminated. RNA purified using the E.Z.N.A.™ MicroElute® Total RNA method is ready for applications such as RT-PCR*, Northern blotting, poly A+ RNA (mRNA) purification, nuclease protection, and in vitro translation.

反转录PCR操作手册1

反转录PCR操作手册1

RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。

高压后烤干备用。

如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。

2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。

3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。

三．试剂配制1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。

2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。

3．异丙醇：放入棕色瓶中。

4．氯仿：放入棕色瓶中。

5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。

使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。

逆转录技术手册说明书

逆转录技术手册说明书

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目录逆转录 | iii仅供科学研究使用1 逆转录 (1)1.1 发现 (1)1.2 发展 (1)1.3 应用...........................................................22 建立逆转录反应 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32.1 步骤 (3)2.1.1 RNA 模板制备 (3)2.1.2 基因组DNA 去除 (6)2.1.3 选择引物 (6)2.1.4 进行逆转录 (8)2.1.5 基因组DNA 去除 (9)2.2 常见逆转录酶及性质 (9)2.2.1 DNA 聚合酶活性 (9)2.2.2 RNase H 活性 (10)2.2.3 热稳定性 (11)2.2.4 持续合成能力 (12)2.2.5 保真度 (14)2.2.6 末端转移酶（TdT ）活性 (14)2.3 常见问题及解决建议 (15)2.3.1 RT -(q)PCR 扩增量低或未扩增 (15)2.3.2 RT -(q)PCR 非特异性扩增 (16)2.3.3 cDNA 截短 (17)2.3.4 cDNA pool 覆盖率低 (18)2.3.5 cDNA 测序错误 (19)3 应用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1 逆转录聚合酶链式反应（RT -PCR ）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1.1 RT -PCR (20)3.1.2 定量RT -PCR (27)3.1.3 直接RT -qPCR (28)3 .2 cDNA克隆和文库构建 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .293.3 cDNA末端快速扩增 (32)3.4 基因表达芯片 (34)3.5 RNA测序 (36)3.6 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP） (38)iv | 逆转录仅供科学研究使用1 逆转录本章内容涵盖逆转录基础、cDNA合成、酶选择、常见问题处理技巧以及cDNA在分子生物学研究中的应用，是适用于各种层级研究人员的学习资源。

反转录试剂盒说明书

反转录试剂盒说明书

行业文档TaKaRa Code：DRR014APrimeScript™ RT-PCR Kit(50次量)目录内容页码●制品说明 1●制品内容 1●保 存 2●原 理 2●试剂盒特点 3●RNA样品制备 3●使用注意 4●反转录引物的选择 5●实验操作 5●实验例 7 ●Q&A8●制品说明PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。

虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。

迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

PrimeScript™ RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。

反转录反应使用了TaKaRa独自开发的新型反转录酶PrimeScript™ RTase；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq TM HS。

本试剂盒具有以下优点：1.进行高效的RT-PCR扩增。

2.在标准的RNA反转录反应温度（42℃）下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，可以避免RNA在高温条件下的降解。

3.能有效抑制非特异性的PCR扩增。

4.使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个A碱基，可以直接克隆于T-Vector中。

本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。

●制品内容（50次量*1）1.PrimeScript™ RTase（for 2 Step）2.5×PrimeScript™ Buffer3.RNase Inhibitor（40 U/μl）4.dNTP Mixture（10 mM each）5.Oligo dT Primer（2.5 μM）6.Random 6 mers（20 μM）7.TaKaRa Ex Taq TM HS（5 U/μl）8.10×PCR BufferⅡ9.Control F-1 Primer*2（20 μM）10.Control R-1 Primer*3（20 μM）11.Positive Control RNA（2×105 copies/μl）12. RNase Free dH2O25 μl 200 μl 25 μl 150 μl 50 μl 50 μl 25 μl 250 μl 10 μl 10 μl 20 μl 1 ml*1 反转录反应20 μl 、PCR反应50 μl体系时可使用50次。

mRNA反转录操作手册

mRNA反转录操作手册

mRNA反转录操作手册
1、在操作过程中应避免mRNA污染，防止mRNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行mRNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。

2、实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。

实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。

3、本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。

所涉及的酶类使用后应尽快放回20℃，避免反复冻融。

4、若起始mRNA的量小于50ng，建议加入mRNA酶抑制剂。

宝生物反转录说明书

宝生物反转录说明书
RT Primer Mix *4 1.0 μl
①的反应液 10.0 μl
RNase Free dH 2 O up to 20 μl*5
37℃ 15 min*6
85℃ 5 sec
4℃*7
*1 20 μl 反应体系可最大使用 1 μg 的 Total RNA。
*2 室温反应时，可以延长至 30 分钟。
低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量
的标准曲线。EASY Dilution 也可以单独购买（TaKaRa Code：D9160） 。
EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用， 对于其他公司的同类制品的适用性本
是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采
取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办
法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。
体系。
5． 制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（for Real Time PCR） ，将 Total RNA 或 cDNA 稀
释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
● ● RNA 样品制备
本制品是将 RNA 反转录成 cDNA 的专用试剂。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，而制备 RNA 的关键
璃容器盛装 （也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器） ， 使用的无菌水需用 0.1%的 DEPC 处理后进行高

反转录说明书

反转录说明书
研究用
Code No. RR036A
PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)
说明书
v201412Da
目录
内容
● 制品说明 ● 制品内容 ● 试剂盒外必备材料 ●保 存 ●特 长 ● 使用注意 ● 操作方法 ● Real Time PCR ● 实验例 ● 附录 ● 关联产品
整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 7500 Real-Time
PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×）。
Primer 进行反转录反应，则不能使用本制品。
● 操作方法
反转录反应 RNA 的制备方法参见“附录”。 1. 按下列组份配制 RT 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
使用量
终浓度
5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） Total RNA
2 μl
0.8 μl 0.8 μl 0.4 μl
2 μl
2 μl 2 μl
1 μl 4 μl
0.4 μM*1 0.4 μM*1
1×
dH2O（灭菌蒸馏水） Total
6 μl 20 μl*4
16 μl 50 μl*4
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0 μM 范围内调
● 制品内容（10 μl 反应×200 次）
1. 5×PrimeScript RT Master Mix（for Real Time）*1

BeyoRT M-MuLV反转录酶 说明书

BeyoRT M-MuLV反转录酶 说明书

BeyoRT M-MuLV反转录酶产品编号产品名称包装M-MuLV反转录酶 2000U D7153 BeyoRT产品简介：¾BeyoRT M-MuLV反转录酶(BeyoRT M-MuLV Reverse Transcriptase)是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶。

和普通的M-MuLV反转录酶相同，BeyoRT M-MuLV反转录酶也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；同时具有Ribonuclease H (RNase H)酶活性，可以选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，但不剪切单链RNA或双链RNA。

¾特点：BeyoRT M-MuLV反转录酶可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶仅能合成长达9kb的cDNA；BeyoRT M-MuLV反转录酶的最适反应温度为42℃并且在50℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶在37℃反应时的一些不足。

¾用途：BeyoRT M-MuLV反转录酶常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。

BeyoRT M-MuLV反转录酶合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。

BeyoRT M-MuLV反转录酶也可以用于DNA探针的标记，以及通过引物延伸(primer extention)来分析RNA。

¾来源：本BeyoRT M-MuLV反转录酶由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片断。

¾活性定义：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37℃. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP,0.4 mM polyA•oligo(dT)12-18.¾纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含BeyoRT M-MuLV反转录酶本身含有的RNase H酶活力以外的RNA酶，满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。

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  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 7500 Real-Time
PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×）。
*2：制作标准曲线时梯度稀释 cDNA 或 RNA 标准品的稀释液。模板 DNA 或 RNA 如果用水或 TE
Buffer 稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验
结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围
内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和 PCR 反应，用其稀释后的样品可直接使
1×
*
RNase Free dH2O
up to 10 μl
* 反应体系可按需求相应放大，10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。
2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下: 37℃ 15 min（反转录反应） 85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应） 4℃ 注意：得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Real Time PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。
-1-
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1． 5×PrimeScript RT Master Mix 在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于 5×PrimeScript RT
Master Mix 粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。 2． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。 3． 本制品中已经加入了反转录 Primer（Oligo dT Primer 和 Random 6 mers），如果要使用 Gene Specific
页码
1 1 1 1 1 2 2 2 5 5 7
● 制品说明
本制品是 2 Step Real Time RT-PCR 用的最佳反转录反应试剂。5×PrimeScript RT Master Mix 中 含有定量 RT-PCR 的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、 Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应 Buffer），加入模板 RNA 和水即可迅速进行反应。使用具有较 强延伸能力的 PrimeScript RTase，与制品 PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Code No.RR037A/B）相同，可以在较短时间内高效合成 Real Time PCR 用模板 cDNA。 本制品合成的 cDNA 可以用于 SYBR® Green 分析法和 TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的与 SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 和 Premix Ex Taq (Probe qPCR)等定量试剂配合使用， 能够进行高性能的基因表达分析。 注意：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR® 为 Molecular Probes Inc.的注册商标。
用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。
注意：EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用，对于其他公司的同类制品
的适用性本公司尚未进行确认。
● 试剂盒外必备材料
热循环仪（或 37℃水浴和 85℃加热块） 反转录反应所用 0.2 ml 和 1.5 ml 的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌）
● 保 存： -20℃。
●特 长
1． 制品为预先混好的 Premix 形式，只需加入模板 RNA 和水便可以开始反应。 2． 可以在较短时间内高效合成 Real Time PCR 用 cDNA，是进行 2 Step Real Time RT-PCR 反应的
最佳试剂。 3． 使用了 Random 6 mers 和 Oligo dT Primer 2 种反转录引物，可以合成最适的 Real Time PCR 用
cDNA。 4． Real-time RT PCR 定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总 RNA 和反转录 cDNA
稀释到较低的浓度。如果用水或 TE Buffer 稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结 果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液 EASY Dilution（for Real Time PCR），将 Total RNA 或 cDNA 稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。
*4 按不同仪器的要求确定反应液的体积。
2. 进行 Real Time PCR 反应 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。当使用 Tm 值较低的引物或两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。 < Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System , StepOnePlus™>
0.8 μl 0.8 μl 0.4 μl
2 μl
2 μl 2 μl
1 μl 4 μl
0.4 μM*1 0.4 μM*1
1×
dH2O（灭菌蒸馏水） Total
6 μl 20 μl*4
16 μl 50 μl*4
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0 μM 范围内调
使用 StepOnePlus™ Real-Time PCR System 和 7300 Real-Time PCR System 时，请使用
ROX Reference Dye（50×）。
-3-
*3 建议在 20 μl 反应液中使用相当于 10 pg～100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。反转录反应 液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。
板。反转录反应液的加入量不能超过 PCR 反应液总体积的 10%。
-2-
2. 进行 Real Time PCR 反应。 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化。当使用 Tm 值较低的引物或两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。 两步法 PCR 扩增标准程序：
1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
使用量
终浓度
SYBR® Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（2×） 12.5 μl
1×
PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） RT 反应液（cDNA 溶液）
Reps：1 95℃ 30 秒 Stage 2：PCR 反应 Reps：40 95℃ 3 秒 60℃ 30 秒 Dissociation Stage
* 使用 StepOnePlus™时请设定在 30 秒。 使用 7300 时请设定在 31 秒。 使用 7500 时请设定在 34 秒。
◆特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司 的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性 化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到 影响。如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。 3. 实验结果分析 反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方 法参见仪器的操作手册。
1.0 μl 1.0 μl 2 μl*2
0.4 μM*1 0.4 μM*1
dH2O（灭菌蒸馏水）
8.5 μl
Total
25 μl
*1 通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0
μM 范围内调整引物浓度。
*2 建议在 25 μl 反应液中使用相当于 10 pg～100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模
Primer 进行反转录反应，则不能使用本制品。
● 操作方法
反转录反应 RNA 的制备方法参见“附录”。 1. 按下列组份配制 RT 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
使用量
终浓度
5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） Total RNA
2 μl
Stage 1：预变性 Repeat：1
95℃ 30 秒
Stage 2：PCR 反应 Repeat：40 95℃ 5 秒 60℃ 30～60 秒
Stage 3：Dissociation ◆特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的 化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反 应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。
两步法 PCR 扩增标准程序： Stage 1：预变性 Reps：1 95℃ 30 秒