反转录cDNA合成试剂盒

RevertAid第一链cDNA Synthesis试剂盒#K1621, #K1622分析证明书质量控制#K1621Lot采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物质量认证人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组成 (2)存储条件 (2)产品说明 (2)注意事项 (3)操作步骤 (6)RT-PCR (6)合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实验对照……………………………………………………………….8 问题分析与解决 (10)** 一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。

存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。

对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。

产品说明RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。

本试剂盒使用RevertAid M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。

该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。

试剂盒中含有RiboLock 重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。

试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。

随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。

oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。

使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。

合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。

3
04 379 012 001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit y Version 6.0
1. What this Product Does, continued
Vial/ Cap
Label
Store the kit at ؊15 to ؊25°C N Store Control RNA (vial 7 in
Cat. No 04 379 012 001) at —70°C or below.
y Version 6.0
Content version: September 2010
9 (7 for b,c) colorless
Water, PCR-grade
Content
a) Cat. No. 04 379 012 001 b) Cat. No. 04 896 866 001 c) Cat. No. 04 897 030 001
a) 1 vial, 1 ml b) 2 vials, each 1ml c) 3 vials, each 1 ml
L In Cat. No. 04 896 866 001 and Cat. No. 04 897 030 001 the control reagents (vial 7 and 8) are not included. Therefore, in these kits vial 7 is Water, PCR Grade.
Random Hexamer Primer
a) 1 vial, 100 ␮l (600 ␮M) b) 1 vial, 200 ␮l (600 ␮M) c) 2 vials, each 200 ␮l (600 ␮M)

逆转录试剂盒原理
逆转录试剂盒是一种常用的实验工具，用于将RNA转录成相应的DNA，以便进行后续的PCR或克隆等实验。

其原理是基于一种酶——逆转录酶的特性，该酶能够将RNA作为模板合成相应的DNA，也就是所谓的cDNA。

逆转录试剂盒通常包含逆转录酶、反应缓冲液、dNTP混合物、随机引物、RNase抑制剂等组分。

在反应开始之前，需要先将RNA样品加入到反应管中，然后加入逆转录试剂盒中的其他组分，并在适当的温度和时间下进行反应。

在反应过程中，逆转录酶会与RNA结合形成逆转录复合物，随机引物会与RNA结合，作为启动子，引导逆转录酶合成cDNA。

缓冲液和dNTP混合物提供了反应所需的离子和核苷酸，而RNase抑制剂则能够保护RNA不被降解。

反应结束后，可用PCR等方法进一步扩增所得到的cDNA。

逆转录试剂盒的原理简单易懂，操作也相对容易，因此被广泛应用于分子生物学和生物医学研究中。

- 1 -。

产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。

其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。

质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。

产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。

试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。

这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。

Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。

合成反应能在15-30分钟内完成。

Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。

试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。

Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。

重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。

Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。

为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。

但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。

在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。

而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。

Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。

同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。

使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。

11-05
高效率逆转录试剂盒 First Strand cDNA Synthesis Kit
ReverTra Ace -α-
(Code No. FSK-100,FSK-101)
使用说明书
科研用
TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN
目录
※ 除Positive Control RNA外，所有组分请均保存在-20℃条件下；Positive Control RNA请保存于-80℃条件下。
※ Positive Control RNA 由于运输过程中不能一直保证 -80℃条件，在运输过程中可能 降解。建议用户选择人、鼠来源的 Total RNA 作为 Control RNA。
G3PDH mRNA
Primer F 559
intron
Size(bases)
1634
1237
1110 Primer R
90 129 90 92 k-193 104
图 2. Control Primer F，R 的 location
[Positive Control RNA]
本 试 剂 盒 作 为 Positive Control 用 RNA ， 添 附 有 Human G3PDH (Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)遗传基因的 in vitro 转录产物。 （在 3’末端添加了 22mer 的 Poly（A）tail）（请参照图 3）。
※ 组分中的 5×RT Buffer 在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时， 请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。
[各引物的序列]

适用范围
RT延伸。
注意事项
1. 下列操作步骤适用于模板量为50 ng-2 μg的总RNA，如果总RNA量大于2 μg，请按比例扩 大反应体系。
2. 在冰上进行操作，防止RNA发生降解。 3. 不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步
KR116-0μl 25 μl 50 μl 1 ml
KR116-02 (100 rxn)
200 μl 200 μl 100 μl 200 μl 2×1 ml
KR116-03 (1000 rxn) 10×200 μl 10×200 μl 10×100 μl 10×200 μl 10×2×1 ml
操作步骤
使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
50 ng-2 μg总RNA可建立20 μl反应体系。
1. 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、 RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液 涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配 制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育 3 min。然后置于冰上放置。
表1 gDNA去除反应体系
组成成分
使用量
5×gDNA Buffer
产品特点
反转录效率高：反转录效率可达95%以上； 操作简单快速：反应体系配制简单，21 min完成cDNA第一链的合成； 通读复杂模板：能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板； 样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高； 后续兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。

反应次数目录号反应次数04 379 012 00150次，包括10次对照反应04 896 866 001100次04 897 030 001200次试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 0011红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2∙2无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)∙3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)∙4黄色/ 紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM∙5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液∙8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物∙9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为04 896 866 001和04 897030 001的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。

2．PCR 反应 ① 按下列组成配制 PCR 反应液，全量 50 μl。
试剂名称 上述 cDNA 溶液 dNTP Mixture（各 2.5 mM） Forward Primer（10 μΜ） Reverse Primer（10 μΜ） 10×LA PCR Buffer II（Mg2＋ Plus） TaKaRa LA Taq®（5 U/μl） dH2O
-2-
④ 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液。 试剂名称
上述模板 RNA/引物变性溶液 5×M-MLV Buffer dNTP Mixture（各 10 mM） RNase Inhibitor（40 U/μl） RTase M-MLV（RNase Hˉ）（200 U/μl） Total Volume
6. 70℃保温 15 分钟后冰上冷却，得到的 cDNA 溶液可直接用于 2nd-Strand cDNA 的合成或者 PCR 扩增等，PCR 扩增时 cDNA 溶液的使用量建议使用 1 μl～5 μl。
●使用λRNA 进行 RT-PCR 反应的实验例
本实验中使用的λRNA 为带有 Poly(A)的λDNA 的转录产物。本实验中分别扩增了 1 kbp、3 kbp、 5 kbp、8 kbp 和 10 kbp 的目的 DNA 片段。
50 % 0.01 %
●起 源： Purified from an E.coli strain expressing a recombinant enzyme.
●活性定义 以Poly（rA）·Oligo（dT）为模板/引物，在 37℃、10 分钟条件下，掺入 1 nmol的 [3H] dTTP所需
要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。
使用量 7 μl 2 μl

cDNA的制备与检测
[实验原理]
总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。

先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器和材料
紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统
(二)试剂
特异引物、逆转录试剂盒
[实验步骤]
（一）cDNA的合成
1、取约9uL mRNA，依次加入：第一链缓冲液4uL，RNA酶抑制剂1 uL，Oligo(dT)引物2uL，dNTP混合液2uL AMV逆转录酶2uL，混匀，离心10min，42℃水浴1h。

2、在冰上于第一链反应产物中，加入以下试剂：第二链缓冲液然40uL，RNA 酶H 1uL，大肠杆菌DNA聚合酶5uL，DEPC处理过的水至100uL，混匀，离心10s，12℃、22℃、65℃水浴各1h。

3、加入T4DNA聚合酶，振荡混匀后离心10s，37℃水浴10min。

4、加入10uL 200mmol／L EDTA和2ul SDS（10%，W/V）
5、加入80uLTE，20uL 3mol／L醋酸钠，400uL乙醇，-20℃放置15min。

6、15000rpm 离心15min。

7、弃上清，稍晾干至无乙醇味，加40uLTE溶解沉淀，即为合成的cDNA。

（二）cDNA电泳检测
取约5ul反应产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外灯下检测，呈现出大小在200—10Kb的拖带，其中重心区域小1—4Kb之间，这说明反转录完全，
得到了高质量的cDNA。

BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)产品编号产品名称包装cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 10次D7166 BeyoRT产品简介：¾BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)，即BeyoRT First Strand cDNA Synthesis Kit (RNase H minus)是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)，用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA第一链的试剂盒。

本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。

¾采用本试剂盒可以合成长达13kb的cDNA第一链。

在采用BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)的情况下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。

¾试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。

¾试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。

也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。

¾试剂盒中提供的Control Primer为17聚，即引物的长度为17个碱基。

试剂盒中提供的Control RNA为带有3’ poly(A)的1.1kb RNA。

¾使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。

¾本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行10个cDNA第一链样品的合成。

包装清单：产品编号产品名称包装D7166-1 BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-) 2000UD7166-2 Reaction Buffer (5X) 50µlD7166-3 RNase Inhibitor (20U/µl) 10µlD7166-4 dNTP Mix (10 mM each) 20µlD7166-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5µg/µl) 10µlD7166-6 Random Hexamer Primer (0.2µg/µl) 10µlD7166-7 Control RNA (20ng/µl) 6µlD7166-8 Control Primer (5pmol/µl) 6µlD7166-9 DEPC-treated Water 0.2ml－说明书1份保存条件：-20℃保存。

（1）反应液的配制和反应 反应液组成（例）
Nuclease-free Water
up to 10μl
Total RNA（<10μg）
Xμl
10×DNase I Buffer
（10mM Tris-Cl, pH7.6, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2）
RNase-free DNase I（10U /μl）
※ 本产品的试剂盒内没有添附 Realtime PCR 试剂。关于 Realtime PCR 产品，推荐使 用本公司的 Realtime PCR 用试剂 Realtime PCR Master Mix 系列。（详情请参考 [7] 相关产品的内容）。
◆本产品特征◆ 1．对应各种不同长度目标片段的高效率逆转录
关仪器。
• Nuclease-free Water 本产品已添附可使用 200 次的 Nuclease-free Water，此外请再准备一些
Nuclease-free Water，以便在稀释模板 RNA 时使用。推荐使用未经过 DEPC 处 理 的 Nuclease-free Water。也可以使 用经 DEPC 处 理 过 的 水，但 残 留的 DEPC 会抑制反应的进行，因此请使用高压灭菌器彻底清除 DEPC 之后再使 用。此外，为防止核酸的混入，用于逆转录反应和 PCR 反应的 Nuclease-free Water，建议和用于其它实验的 Nuclease-free Water 分开保存，避免共用。 • Total RNA
【注意】
本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试 剂用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护 用品，安全操作。
【保存】
所有组分请均保存于 -20℃条件下。

成功的 cDNA 合成来自高质量的 RNA。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如 EDTA 或 SDS。用于
cDNA 合成反应的溶液试剂尽可能用 DEPC 进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经为了增加贮存 RNA 样品的稳定性，可 以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存 于-70℃。用 于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。 来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时，可以使用下列方法沉淀 RNA：加入 NaCl 至 0.2 M 及 4 倍体积的乙醇，室温放置 3-5 min，10,000 rpm 离心 5 min。
东盛生物出产的 M-MLV 是由一个 71kDa 的单亚基组成的重组型 DNA 逆转 录聚合酶。可以催化以 RNA 或 DNA：RNA 杂交链为模板的互补 DNA 的聚 合反应。本酶经修饰 RNaseH 活性比普通的逆转录酶要弱很多，因此在合成第 一链 cDNA 的过程中，可保证 RNA 的降解程度较低，从而使得率提高。
逆转录系列
RT-PCR Kit（逆转录试剂盒）
产品组分 组分 M-MLV（200 U/μl） RNase（40 U/μl） Oligo（dT）15（50 μM） Random primer（50 μM） 5×first-strand buffer RNase-free ddH2O dNTPs（10 mM each） 说明书
20 次逆转录反应，R1012 可进行 100 次逆转
录反应（20 μl 标准 PCR 反应体系，每次使用 M-MLV 1 μl）。
M-MLV 储存液 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 200 mM NaCl 0.1 mM EDTA 1 mM DTT 0.01% NP-40 50% glycerol 5xfirst-strand buffer 成分 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ℃) 375 mM KCl 15 mM MgCl2 50 mM DTT 保存条件 各组分均-20℃保存，避免反复冻融。

行业文档TaKaRa Code：DRR014APrimeScript™ RT-PCR Kit(50次量)目录内容页码●制品说明 1●制品内容 1●保 存 2●原 理 2●试剂盒特点 3●RNA样品制备 3●使用注意 4●反转录引物的选择 5●实验操作 5●实验例 7 ●Q&A8●制品说明PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。

虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。

迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

PrimeScript™ RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。

反转录反应使用了TaKaRa独自开发的新型反转录酶PrimeScript™ RTase；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq TM HS。

本试剂盒具有以下优点：1.进行高效的RT-PCR扩增。

2.在标准的RNA反转录反应温度（42℃）下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，可以避免RNA在高温条件下的降解。

3.能有效抑制非特异性的PCR扩增。

4.使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个A碱基，可以直接克隆于T-Vector中。

本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。

●制品内容（50次量*1）1.PrimeScript™ RTase（for 2 Step）2.5×PrimeScript™ Buffer3.RNase Inhibitor（40 U/μl）4.dNTP Mixture（10 mM each）5.Oligo dT Primer（2.5 μM）6.Random 6 mers（20 μM）7.TaKaRa Ex Taq TM HS（5 U/μl）8.10×PCR BufferⅡ9.Control F-1 Primer*2（20 μM）10.Control R-1 Primer*3（20 μM）11.Positive Control RNA（2×105 copies/μl）12. RNase Free dH2O25 μl 200 μl 25 μl 150 μl 50 μl 50 μl 25 μl 250 μl 10 μl 10 μl 20 μl 1 ml*1 反转录反应20 μl 、PCR反应50 μl体系时可使用50次。

本公司利用基因工程学的方法改变了来自 MMLV (Molony murine leukemia virus) 的逆转录酶，使阻碍合成长链 cDNA 的 RNase H失活，成功 开发了大幅度提高 cDNA合成能力的改良型酶ReverTra Ace 。
ReverTra Ace -α-(Code No.:FSK-100,FSK-101)是以ReverTra Ace为核 心酶的First strand cDNA合成试剂盒。由于本试剂盒包含了RT用引物及Positive Control，所以能够简单地进行逆转录反应。也可以应用于手头上各种DNA聚合 酶的PCR反应模板的制备。例如，通过和High fidelity PCR用酶，Long PCR用 酶等的结合，能够进行目的性更强的RT-PCR。
【 保存 】
•除Positive Control RNA以外，其他组分请均保存于-20℃条件下。 •Positive Control RNA请保存于-80℃条件下。 ※ Positive Control RNA由于运输过程中不能一直保证-80℃条件，在运输过
程中可能降解。建议用户选择人、鼠来源的Total RNA 作为Control RNA。 •为了保证实验效果，请在收到产品的一年之内使用完毕。
G3PDH 基因是在各种哺乳类组织上表达的“管家基因”。其 mRNA 表达水 平不受一部分细胞因子和含有 Tumor-promoting Phorbol Esters 等的诱导物质 的影响，并且，在几乎所有组织上都是恒定的。因此，使用从各种组织中抽提出 来的 RNA 样品的时候，可以作为最合适的对照而使用。
↓
99℃、5 min. *****
↓
4℃、5 min.
↓
瞬间离心
5

反转录试剂盒TAKARA6210A操作步骤Code No. 6210A 研究⽤PrimeScript? II 1st StrandcDNA Synthesis Kit说明书⽬录内容页码●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●1st-strand cDNA合成反应 2 ●RT-PCR反应 2 ●RNA样品的制备 3 ●相关产品 3●制品说明本制品是使⽤PrimeScript II RTase从Total RNA或Poly (A)＋ mRNA合成1st Strand cDNA的试剂盒。

含有1st Strand cDNA合成所需的全部试剂。

以结构复杂的RNA或长链RNA为模板进⾏cDNA合成时，cDNA合成受到抑制的主要原因是RNA⾼级结构与反转录酶的⾮特异性结合。

并且，由于反转录酶的错配引起的⾮特异性延伸，对RT-PCR或全长cDNA的合成极为不利。

PrimeScript II RTase是对PrimeScript RTase进⾏进⼀步改良的反转录酶，本反转录酶可以极⼤限度地抑制RNA⾼级结构与反转录酶的⾮特异性结合。

本制品使⽤了PrimeScript II RTase，利⽤Oligo dT从PolyA开始进⾏延伸反应，使⽤标准反转录温度42℃，不仅能维持PrimeScript RTase原有的卓越的cDNA合成效率和cDNA合成速度，同时可以合成本底低、纯度⾼、完整性好的cDNA。

另外，反转录反应液配制时所产⽣的⾮特异性延伸是抑制cDNA合成的主要原因，本制品能有效控制这⼀现象。

反应液配制后，冰上放置直⾄反转录反应开始，不会发⽣抑制cDNA合成的现象。

合成的1st Strand cDNA可⼴泛应⽤于2nd Strand cDNA合成、杂交、PCR法扩增等。

特别适⽤于全长cDNA⽂库制作、⾼纯度全长cDNA合成等。

●制品内容(50次量)PrimeScript II RTase (200 U/µl) 50 µl5×PrimeScript II Buffer 200 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 25 µl dNTP Mixture (10 mM each) 50 µl Oligo dT Primer (50 µM) 50µl Random 6 mers (50 µM) 100 µl RNase free dH2O 1 ml【各种引物序列】* 该序列与RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. RR019A)中的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有与M13 Primer M4匹配的序列。

*1 Random 6 mers 和 Oligo dT Primer 同时使用，可有效地将全长 mRNA 反转录成
cDNA。使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：
Random 6 mers（100 μM） 2.0 μl（200 pmol）
Oligo dT Primer（50 μM）
0.5 μl（25 pmol）
热循环仪（或 37℃、42℃水浴和 85℃加热块） 反转录反应所用 0.2 ml 和 1.5 ml 的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌）
● 保 存： -20℃。
●特 长
1． 可以快速、高效合成 Real Time PCR 用 cDNA，是进行 2 Step Real Time RT-PCR 反应的最佳试 剂。
2． 含有 Oligo dT Primer 和 Random 6 mers 两种反转录引物，可根据实际情况区别使用。反转录反应 可以使用 Random 6 mers 或 Oligo dT Primer，也可以 Oligo dT Primer 和 Random 6 mers 同时 使用。只扩增一种目的基因时，也可以使用 Specific Primer 作为反转录引物。
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1． 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix；其中包括 RNase Free dH2O、
Buffer、酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免 重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2． PrimeScript RT Enzyme Mix I 使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有 50%的 甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不要使 Tip 插入液 面过深，否则会因 Tip 壁粘着造成损失。 3． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。