核酸等温扩增杨银辉 ppt课件
- 格式:ppt
- 大小:6.35 MB
- 文档页数:44
五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【摘要】目的建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法.方法通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响.结果五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增.结论建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测.%Objective To establish a one-step recombinase polymerase amplification (RPA) method for pathogen screening and rapid detection in the field targeting for five hemorrhagic fever related viruses (Zaire ebola virus, Sudan ebola virus, Marburg virus, Lassa virus and Yellow fever virus). Methods The specific nucleic acid (NA) fragments of each virus were selected as target genes by genome sequence analysis, and the primers and probes for RPA assays were designed according to the sequence. A series of diluted template genes were used for RPA detection to determine the sensitivity. The hemorrhagic fever-related viral nucleic acids were used for RPA detection to determine the specificity. The amplification experiments were carried out at di fferent temperature ranging from 37℃ to 42℃ to validate thereaction temperature range. Results The RPA reaction systems of the five hemorrhagic fever viruses could effectively amplify the target genes, the sensitivities were between 1.5×102 and 1.5×103 co pies. No cross reactions existed with the other hemorrhagic fever-related viral genes. Meanwhile, RPA assay could effectively amplify the target genes at 37-42℃. Conclusion The isothermal RPA assays of five hemorrhagic fever viruses are established, which may amply target genes fast and react at a wide temperature range, and be potentially useful for in field pathogens detection.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(042)006【总页数】6页(P526-531)【关键词】重组酶聚合酶检测;等温扩增;出血热病毒【作者】曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【作者单位】230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R373.3埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)、马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)、拉沙病毒(Lassa virus,LASV)和黄热病毒(yellow fever virus,YFV)均为烈性出血热病毒,主要流行于非洲,均可引起严重的出血热症状,感染率和致死率很高。
详解核酸等温扩增技术近年新发展起来的核酸等温扩增技术,无论是在实际操作还是仪器要求方面,都比PCR 技术更为简单方便,它摆脱了对精良设备的依赖,在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。
在众多等温扩增技术中,环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用,其他一些新发展起来的等温扩增技术,如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术,也在不断发展与完善之中。
为了更好地有选择地开发利用这方面技术,现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP )环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术,其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物,包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物,3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶,使得链置换DNA合成不停地自我循环,从而实现快速扩增。
反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。
此反应先形成哑铃状模板,进入循环扩增阶段,再进行伸长、循环扩增,共3个阶段。
Loop-mediated isothermal amplification(LAMP,Fig1)依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can -gene 公司首次介绍。
它是一项以核酸序列中RNA为模板,由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。
整个反应由非循环相和循环相组成: 首先进行非循环相,在AMV 逆转录酶的作用下,引物I 与模板RNA 退火后合成cDNA,形成RNA/DNA 杂合体,随即RNaseH 降解 RNA,引物Ⅱ与 cDNA 退火,合成第二条 DNA 互补链。