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S D S P A G E操作方法要点 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】SDS-PAGE教程1SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与去污剂结合。
当分子量在15KDa到200KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K–bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE[Laemmli法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！SDS-PAGE各试剂配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
（一）安装夹心式垂直版电泳槽各部分依下顺序安装：装上储槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上；将长、短玻璃板分别插到硅胶框的凹形槽中。
注意勿用手接触灌胶面，以保持玻璃清洁；将已插好玻璃板的凝胶模平方在储槽上，短玻璃板应面对上储槽；将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
竖直电泳槽，用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶膜间的缝隙。
加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。
琼脂（糖）溶液用不连续体系电极缓冲液配制。
（二）配胶及凝胶板的配制1、配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。
2、凝胶板的配制分离胶的制备：按表配制20mL10%的聚丙烯酰胺（PAA）溶液，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内，约8cm高，用1mL注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入，约3~4mm高，以进行水封。
30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。
倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
浓缩胶的制备：按表配制10mL3%的PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离玻璃板上缘约0.5cm处轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置20~30min，使凝胶“老化”。
小心拔去样品槽模板，将pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下储槽中，应没过短玻璃板0.5cm以上，即可准备加样。
(电极缓冲液即pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%的SDS)（三）样品的处理与加样样品的处理：称取0.5~1mg蛋白质加1mL样品溶解液处理，溶解后，在100摄氏度沸水浴中保温3min，取出冷却后取样电泳。
（如处理好的样品暂时不用，可放在-20摄氏度冰箱内保存，使用前在100摄氏度沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合物。
）加样：（加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10~15uL(即2~10ug蛋白)；如样品较稀，加样体积可达100uL。
各项检验操作注意事项一.SDS-PAGE操作及注意事项1.制胶按如下配方制备分离胶和浓缩胶4%浓缩胶（3ml）10%分离胶（4ml）AB-3 0.25mLAB-6 0.8mL3×gel buffer 0.75mL 1.335mL50%甘油(v/v) 0.64mLH2O 2mL 1.235mL10%APS(w/v) 22.5uL 20uLTEMED 2.25Ul 2uL注意事项：（1）配制前先将两块玻璃板夹紧，可以先试漏。
首先配置分离胶，用水封，静置40min 后，将水吸干，再注入浓缩胶，插上梳子，注意要避免梳孔出现气泡。
（2）在加入APS（10%过硫酸铵）和TENED后要尽快将胶注入，防止其凝固后无法注入玻璃板内。
2. 电泳注意事项：（1）制样：取40uL待测样，加入10uL5×SDS PEGE loading buffer，混匀后煮沸10min （电磁炉1000W），制好的样放至室温后，放4℃保存，待电泳。
（2）电泳：在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同装置放入电泳槽中，在两块胶之间注入阴极缓冲液。
取2uL Marker注入胶孔中作为参照，再一次取5uL样品缓慢注入胶孔中，调整电压800-100V。
待溴酚蓝从浓缩胶进入分离胶后，电压加至120-155V。
继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源。
小心撬开玻璃板，除去浓缩胶，取出分离胶，加入R250考马斯亮蓝染色40min，再用脱色液脱色。
3. 溶液的配制：（1）正极缓冲液Anode buffer(1×)：12.114gTris加少量ddH2O溶解后，用HCL调PH至8.9，最后用容量瓶定容至500mL，4℃保存。
（2）负极缓冲液Cathode buffer (1×)：6.057gTris+8.96gTricine+0.5SDS加入少量ddH2O 溶解后，定容至500mL，4℃保存。
（3）凝胶缓冲液Gel buffer (3×)：36.342gTris+0.3gSDS加ddH2O定容至100mL，HCL调PH=8.45，过滤4℃保存。
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.815.1g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.35×电极缓冲液 Tris2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。
SDS—PAGE标准操作规程一、试剂（一)储存液(1)2M Tris-HCl （pH8.8),100ml称取24.2g Tris碱；加50ml蒸馏水;缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高;加蒸馏水至100ml.(2)1M Tris—HCl（pH6.8）,100ml称取12。
1g Tris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH6。
8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml.(3)10%(w/v)SDS，100ml。
室温保存称取10g的SDS；加蒸馏水至总量为100ml.(4)50%（v/v）甘油，100ml倒取50ml 100%的甘油；加入50ml蒸馏水。
(5)1%(w/v)溴酚蓝，10ml称取100mg溴酚蓝；加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。
（二)工作液(1)30％（w/v)丙烯酰胺/0。
8%（w/v）双丙烯酰胺30g丙烯酰胺0.8g双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套在通风柜操作，加蒸馏水至100ml,缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，过0.45μm滤膜。
可在4℃存放数月。
(2)4×Tris-Cl/SDS (pH8。
8 1。
5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS)91g Tris base2g SDS加水300ml,用1N HCl调pH至8.8,再加水至500ml过0.45μm滤膜，4℃存放(3)4×Tris-Cl/SDS (pH6.8 0.5M Tris—Cl Containing 0.4%SDS)6。
05g Tris base0.4g SDS加水40ml，用1N HCl调pH至6。
8，再加水至100ml过0.45μm滤膜，4℃存放(4)10％过硫酸铵APS0.1g过硫酸铵1ml蒸馏水长期不用应-20℃干燥分装保存，临用前再加D。
SDS-PAGE教程1 SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4 g去污剂结合。
当分子量在15 KDa到200 KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K – bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE [Laemmli法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！SDS-PAGE各试剂配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】各种组分名称体积(mL)或质量(g) 备注30%Acr-Bis(29:1) 100 mL 实验室配制时用量(100 mL)29% Acrylamide(丙烯酰胺) 29 g 29.2 g1% BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 1 g 0.8 g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
细胞因子电泳纯度（非还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于细胞因子纯度的检测。
目的：检测细胞因子蛋白质纯度。
原理：蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。
由于不连续的PH梯度作用，样品被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。
内容：1 材料1．1样品：经二人复核批号无误后检测1．2试剂甲醇 CH3OH 分析纯无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甘油 C3H8O3分析纯硝酸银 AgNO3分析纯重铬酸钾 K2Cr2O7分析纯正丁醇 C4H9OH 分析纯甲醛 HCHO 分析纯丙烯酰胺 CH2CHCONH2分析纯甲叉双丙烯酰胺（CH2CHCONH2）2CH2分析纯过硫酸铵（NH4）2S2O8分析纯TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2分析纯甘氨酸 C2H5NO2分析纯SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa 分析纯乙酸 CH3COOH 分析纯碳酸钠 Na2CO3分析纯溴酚蓝 C19H10Br4O5S 分析纯1．3注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．4设备1．4．1扭力天平上海第二天平仪器厂1．4．2垂直板状电泳槽北京东方仪器厂1．4．3恒温恒流电泳仪法玛西亚公司1．4．4快速电泳槽BIORAD USA1．4．5全自动扫描仪CS-930 日本岛津1．4．6TS-1型摇床1．5器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。
2 方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
SDS-PAG教程1 SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4 g去污剂结合。
当分子量在 15 KDa到200KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K - bX ,式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE [Laemmli 法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别，不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAG（不连续系统）的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据，许多论文在描述其 SDS-PAGE寸引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE勺基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli!migration_______ U方法30%聚丙烯酰胺溶液——30% (w/v) Acrylamide【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N'-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37C左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。
0.45卩m微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4 'C避光（用铝箔纸包扎起来）保存。
严格核实pH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
【保存条件】4 C避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N'-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
1 M Tris-HCI ( pH6.8)(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1 M Tris-HCl【配制方法】称量12.1 g Tris 碱溶于80 mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9 mL的浓HCI调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。
应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1C,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
【保存条件】室温保存。
【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。
【组分浓度】1.5 M Tris-HCl【配制方法】100 mL称量18.17 g Tris 碱溶于80 mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约 3 mL浓HCI调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。
【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1C，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
【组分浓度】10% (w/v) SDS【配制方法】称取2 g高纯度的SDS置于100~200 mL烧杯中，加入约16 mL的去离子水，于68 C加热溶解，滴加浓盐酸调节pH 至7.2，定容至20mL后，室温保存。
【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害，请注意防护。
10% 过硫酸铵溶液-----10% (w/v) APS 【组分浓度】10% (w/v)过硫酸铵(APS)【配制方法】称取0.1 g过硫酸铵置于1.5 mL离心管，加1 mL去离子水吹打溶解，亦可以加倍，即称取 1 g过硫酸铵，加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。
4 'C保存。
【保存条件】4C保存【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4C保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。
5XTris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5X Tris-Glycine buffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)【组分浓度】【配制方法】称取15.1 g Tris，94.0g甘氨酸（glycine ），5.0gSDS,用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000 mL，室温保存。
得0.125 mol/L Tris-1.25 mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释 5 倍。
【保存条件】室温保存，两年有效。
【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。
电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。
【组分浓度】0.25 M Tris-HCl (pH 6.8);10% (W/V)SDS;0.5% (W/V) BPB(溴酚蓝);50% (V/V)甘油；【配制方法】量取 1.25 mL 1 M Tris-HCI ( pH 6.8 ), 0.5 g SDS , 25 mg BPB, 2.5 mL 甘油，置于10 mL 塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至 5 mL，小份(0.5 mL/份)分装，于室温保存。
使用前将25卩L的2-ME加入到每小份中。
加入2-ME的Loading Buffer 可在室温下保存一个月左右。
【保存条件】-20 'C保存，至少一年有效。
【注意事项】SDS-PAG蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT或 3 -巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。
二者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于3 -巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于3 -巯基乙醇。
DTT的最佳工作pH范围为7.1-8.0，但DTT价格略高一些。
蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是1-10 mM。
摘自Takara商品目录--实验室常规试剂配制方法0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸考马斯亮蓝R250染色，染色时间控制在 0.5-1h 。
(注意：(1)保存考马斯亮蓝 R250可回收使用，可保存很长时间，但一般不超过6个月；(2)染色时间过长难以脱色，过短染色效果不佳；)10%(v/v)5%(v/v)脱色(三个小时后应换次脱色液，再重新加入脱色液且约需脱色24小时，直到背景清晰为止)(1)蒸馏水中冲洗2-3次(2)7%冰乙酸固定(3)7 %冰乙酸10 %乙醇83ml蒸馏水脱色(4) 7%冰乙酸保存(要检测脱色后的胶，则需保存于7%冰乙酸中)蒸馏水冲洗T 7%冰乙酸(关键步骤)，10%乙醇脱色脱色液：7%冰乙酸，10%乙醇，83ml蒸馏水7%冰乙酸保存(蒸馏水冲洗后用7%冰乙酸保存且约二〜四天后再照胶，条带更为清晰)【组分浓度】50% (V/V)甲醇，10% (V/V)醋酸银氨染色用凝胶处理液50% (v/v)10% (v/v)银氨染色用凝胶染色液0.4% (w/v) AgNO 31% (v/v) NH H2O, 0.04% (w/v) NaOH【配制方法】取上述试剂加入100〜200 mL的试剂瓶中，均匀混合。
该溶液应为无色透明状。
如果氨水浓度过低时溶液会呈混浊状，此时应补加浓氨水直至透明。
本染色液应现用现配，不宜保存。
0.005% (w/v)柠檬酸，0.02% (v/v)甲醛SDS-PAG凝胶配方1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE勺分离胶(即下层胶)：来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。
TBST缓冲液1）抗体去除液SDS-PAG操作方法1、20uL收集液，加入 5 X样品缓冲液 5ul，在80 C水浴锅中煮 5min。
按照上面配方制 SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。
3、按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般0.75mm间隙15孔的上样量＜10uL/孔,1mm间隙10孔的上样量＜20ul/孔。
上样量根据实际经验自己掌握。
4、打开电源将电压调到 80v （—般15min左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。
5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇 2 — 3h6、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜7、将脱色液倒掉，可以用 Quality One,或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。
SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。
所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天胶的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED勺使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。
借鉴Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的SDS-PAGE中加入约13%勺甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。
只要把原来配方中的水换成60%勺甘油，就可以了。
在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！特别是对分离糖蛋白的时候很有用处！一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生，另一方面对分离小分子量的蛋白有好处！一般加的量在 0.5 — 3g尿素/12ml分离胶！自己可以跑来实验一下你跑9KD分子量的蛋白，建议用tricine-sds-page 电泳来跑！也可以在分离胶中加尿素！以我经验来看，加尿素会好于甘油！电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。
接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。
室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。
蛋白质向正极移动。
待染料前沿移动至管底近处，停止电流。
电泳时间为1-2小时。
加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。
然后放水平摇床上摇 20分钟，最多半小时就染好了。
