下载文档原格式
Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
1. 配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
3.37度，温箱中孵育30min。
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western 操作流程1.SDS-PAGE电泳，事先调整好蛋白质样品的浓度，保持一致。
2.转膜（电泳结束前20分钟开始准备，而垫片和滤纸至少1小时前浸泡于含SDS的转移缓冲液中）。
（1）. 剪适当大小的PVDF膜，正常大小：5.5cm*8cm。
?（2）. 甲醇10mL浸泡膜5min，然后按1：4体积比向浸泡膜的容器中加水40mL至甲醇终浓度为20％(慢加快摇) 计时2 MIN。
（3）. 将膜转入无SDS转移缓冲液中（至少浸泡15分钟），慢摇。
（4）. 同时将电泳好的胶转移至无SDS的转移缓冲液中，慢摇10min。
（5）. 按湿转芯，黑面-垫片-滤纸-胶-膜-滤纸-垫片-白面的顺序放好，并且每层都要用玻璃棒赶走气泡，装槽时要黑对黑，白对白，加入含SDS转移缓冲液。
（7）. 湿转100V 1h-1.5h，转移槽中放入冰盒，冰水混合物上进行或者磁力搅拌器搅拌4度层析柜进行。
3. 封闭。
转膜结束后，将膜与胶接触的面为正面朝上， TTBS 缓冲液中浸泡片刻或者直接转移至封闭液中（5%脱脂牛奶），封闭1-2h1.5H。
4.一抗孵育。
封闭结束后，将膜在TTBS缓冲液中洗2次，每次2分钟，将膜转移至一抗孵育盒（5% 牛奶+ 一抗）中，4°C过夜孵育或者室温孵育3h。
注意：4°C过夜孵育的一抗可收集起来放于4°C，一周之内应该没问题，但是在重复使用这些一抗时，还得再加入比原来比例低的一抗，例如，原来按1：5000加的一抗，那么这次可在回收的一抗中按1：10000加。
5. 膜在TTBS缓冲液洗3次，每次6min1.二抗孵育。
将膜转移至二抗孵育盒中（5%牛奶+二抗），1-2h1.5H。
7. TTBS洗膜三次，每次6min.8.ECL Plus检测液检测：（Western Blot 超敏发光液A和B按1：1比例混匀）注意：Western Blot 超敏发光液 4°C避光保存。
使用前需恢复至室温，所以要提前从冰箱中取出。
western-blot实验操作步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
可按照以下步骤操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制， 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳（1）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
（2）电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
（3）为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)（1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。
硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
免疫印迹（Western blot）法标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫印迹实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂：30%的储备胶溶液，1M Tris-HCl pH8.0，1.5M Tris-HCl PH6.8，10%SDS 溶液，TEMED，10% APS溶液，10X电泳缓冲液，2X SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，转膜缓冲液（TBS），0.01M PBS，丽春红染液，封闭液（5%的脱脂奶粉TBS），相应的一抗、二抗等。
2、规程：
1）SDS-PAGE电泳规程见SDS-PAGE SOP
2）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，3次×5min。
3）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中，10min。
4）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极（+）碳板、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极（—）碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，装入电泳转移槽中，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr或18V过夜，转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。
3）封闭：将膜转入一容器中加入封闭液，于摇床上室温振荡2H；
4）加入一抗：弃去封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次，按合适稀释比例加入一抗，液体必须覆盖膜的全部，4℃过夜。
5）洗膜：取出NC膜，用PBS洗膜，3次×5min；
6）加入二抗：加入适当比例二抗，于摇床上室温振荡2h；
7）曝光、显影：用PBS洗膜，3次×5min，配制显色液（按说明书要求），将膜浸入其中片刻后压片，通过曝光时间的长短调节蛋白条带的亮度和背景的强弱。
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
生物化学实验中的蛋白质分析技术蛋白质分析技术在生物化学实验中的应用在生物化学实验中，蛋白质分析技术是一项十分重要的技术。
蛋白质是生物体中最基本的分子组成部分之一，对于研究生物体的生化过程和功能具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质分析技术，包括SDS-PAGE、Western Blot、质谱分析和免疫沉淀等。
重点讲述这些技术的原理、操作步骤以及其在生物化学实验中的应用。
一、SDS-PAGE技术SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳的方式将蛋白质样品分离成不同的电泳带来研究其分子量和组成。
1. 原理：SDS-PAGE利用带负电荷的SDS使蛋白质样品具有净电荷，根据蛋白质分子量的不同，通过电泳的方式将蛋白质分离到聚丙烯酰胺凝胶中，然后用染色方法可视化蛋白质电泳带。
2. 操作步骤：制备凝胶、样品处理、电泳、染色等。
3. 应用：常用于估计蛋白质的分子量、纯度和相对表达水平等。
二、Western Blot技术Western Blot是一种用于检测特定蛋白质的技术，常用于研究蛋白质的表达、定位和相互作用等。
1. 原理：Western Blot主要由蛋白质电泳分离、转膜、蛋白质与抗体的特异性结合以及信号检测等步骤组成。
2. 操作步骤：SDS-PAGE分离蛋白质、转膜、抗体孵育、信号检测等。
3. 应用：常用于检测特定蛋白质在不同样品中的表达差异、研究蛋白质的翻译后修饰等。
三、质谱分析技术质谱分析技术是一种可以确定蛋白质分子量和氨基酸序列的方法，广泛应用于蛋白质鉴定和结构研究等领域。
1. 原理：质谱分析技术常用的方法有质谱图谱分析和串联质谱分析。
2. 操作步骤：样品制备、质谱分析、数据解析等。
3. 应用：常用于蛋白质的鉴定、研究蛋白质的翻译后修饰、蛋白质定量等。
四、免疫沉淀技术免疫沉淀技术是一种通过特异性抗体与特定蛋白质结合，进而将目标蛋白质从混合物中分离出来的方法，常用于研究蛋白质相互作用以及功能等。
医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。
蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。
血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。
细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。
膜蛋白的抽提比较复杂。
膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。
外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。
固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。
在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。
较为理想的增溶剂是去垢剂。
目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。
增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。
纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。
抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。
主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。
常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。
2. Lowry法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
用前用酒精干燥。
2灌胶与上样：(1)、玻璃板对齐，放好胶条，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）(2)、配分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用枪吸取胶沿玻璃注入，待胶面升到中间线偏高时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）(3)、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（约30min）。
胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)、配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部，以去除未聚合的丙烯酰胺，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板。
）(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5ml离心管中，加入一份4×SDS和3份蛋白样品。
上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
（在缓冲液中加样。
）(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。
SDS-PAGE及Western Blot简明操作指南一．蛋白样品制备✓推荐使用RIPA裂解液。
一般使用强裂解液，对于coIP可用弱裂解液。
1.准备工作：1)取足量裂解液，加入PMSF和（或）蛋白酶抑制剂；若要检测蛋白磷酸化，推荐加入磷酸酶抑制剂。
置于冰上预冷。
2)准备足量PBS，置于冰上预冷。
3)提前打开离心机预冷至4度。
2.裂解样品：（注意保持样品处于冰上，4度离心）1)动物组织：取1g左右置入离心管，加入配制好的裂解液0.5-1ml，置于冰上，用匀浆器充分匀浆；2)悬浮细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；300g离心10分钟，去除培养基，收集细胞；1ml 预冷的PBS重悬后，转移到1.5ml离心管中，300g离心10分钟，去除上清；加入60-200ul裂解液重悬细胞，置于冰上，裂解5-10分钟；裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。
3)贴壁细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；去除培养基，用1ml PBS洗涤细胞；去除PBS，加入60-200ul裂解液，置于冰上，裂解2-3分钟；用细胞铲刮掉细胞，用移液器转移到1.5ml离心管中；置于冰上，裂解5-10分钟，裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。
3.收集蛋白：1)将上述裂解样品于4度10000g离心10-20分钟，转移上清至一新的离心管，此即为蛋白样品。
此处样品可于-20或-80度长期保存。
4.蛋白的相对定量：BCA法✓为保证各样品western上样蛋白量一致，须定量蛋白；推荐相对定量；绝对定量需要在本方法基础上额外做BSA标准曲线。
✓备注：每个蛋白要做2个重复，blank对照须使用步骤2中的裂解液。
1)参考说明书，配制足量BCA工作液（多配制10%，以免不足）；2)取一96孔酶标板，在要用到的孔中加入上述BCA工作液，每孔100ul;3)在上述孔中分别加入1-2ul各蛋白样品及blank对照；4)将酶标板于37度孵育10-30分钟，直到出现较明显颜色变化即可；5)测定吸光度；6)计算相对蛋白含量：各吸光度去除blank背景，以吸光度最低者为参考，进行归一化处理，即计算吸光度倍数关系；western上样时，须依据此倍数关系调整各样品上样体积，以保证各样品上样蛋白量一致。
5.western用蛋白样品的制备：1)向步骤3中的蛋白样品中，按1：4体积比例，加入5XSDS-PAGE loading buffer，混匀；2)80-90度加热10分钟，变性蛋白。
此处样品可保存于4或-20度。
二．SDS-PAGE蛋白胶配制及电泳1.SDS-PAGE蛋白胶配制✓分离胶浓度越高，分辨率越高；即蛋白之间分子量差异越小，需要越高浓度的分离胶才可将其分离开。
常规使用8-10%分离胶。
✓每块1.0mm胶需要准备5ml分离胶和3ml浓缩胶。
✓过硫酸铵APS溶液易失效，若4度保存超过1个月，请及时重新配制；✓配制好的胶，若暂时不用，及时用保鲜膜包裹，置于室温或4度，以免失水变性。
1)组装制胶用玻璃板，固定于制胶底座上；2)配制分离胶：向50ml离心管中，按配制表依次加入各组分，轻轻颠倒混匀（TEMED用量可增加2-5倍以缩短凝胶时间）。
尽快向玻璃板腔加入4-4.5ml胶液，然后轻轻加入0.5-1ml 90%异丙醇水溶液。
静置20-40分钟以凝固胶液。
略倾斜制胶底座，胶面不倾斜，即已凝固。
3)分离胶凝固后，倒去上层异丙醇溶液，用水洗涤若干次，以彻底清除异丙醇残留。
4)配制浓缩胶：向50ml离心管中，按配制表依次加入各组分，轻轻颠倒混匀。
尽快向玻璃板腔加入胶液，以胶液刚溢出为准，插入制胶梳子（先插入一端，再逐渐插入另一端）。
静置10-30分钟以凝固胶液。
凝固后即可取下玻璃板，使用或保存。
2.SDS-PAGE蛋白胶电泳✓SDS-PAGE running buffer电泳液可重复使用，但以不超过10次为宜。
✓一个电泳槽最多可同时进行4块蛋白胶电泳，请按电泳槽上的指示线加入适量的电泳液。
1-2块胶须加到下指示线，约600ml；3-4胶须加到上指示线，约1100ml。
✓ 1.0mm蛋白胶每孔上样最多30ul；若超出此体积，须先上样一部分，电泳1-2分钟之后，再上样余下部分。
✓按电极颜色指示安装电泳槽，以免颠倒正负极。
✓一般电泳，电压可用60-200V；电压越高，电泳越快，但发热越多，条带可能变形。
1)组装电泳内槽。
（可先加满水静置1-2分钟，以测试是否漏液；明显漏液须重新组装；无明显漏液，倒去水，进行下一步）2)上样：将组装好的电泳内槽置于电泳槽中，向内槽中加满running buffer；双手平衡用力，垂直拔出梳子（若上样孔有蛛网状残胶，可用200或1000ul移液器轻轻吹洗）；用10ul移液器，向上样孔中加入制备好的蛋白样品（见一.5）及蛋白marker。
3)电泳：向外槽加入running buffer至指示线；安装电泳槽盖，接通电源；100-120V电泳。
目的条带被很好地分离时，即可停止电泳。
4)回收内外槽电泳液。
5)用水冲洗内外槽，以去除残留电泳缓冲液，利于转膜。
三．Western Blot1.SDS-PAGE蛋白胶转膜✓transfer buffer转膜液含20%甲醇。
可重复使用，但以不超过5次为宜。
✓一个电泳槽最多可同时进行2块蛋白胶转膜，约需1000ml transfer buffer。
✓转膜液须提前在4度或冰中预冷。
✓PVDF膜须用甲醇浸泡湿润活化1-2分钟，方可使用。
NC膜不需此步。
✓转膜过程易产热，为加速散热，可将转膜槽置于装有冰水混合物的盒子或盆子中。
✓转膜电压越高，转膜越快，但发热越严重。
✓蛋白分子量越大，所需转膜时间越长。
1)蛋白胶、滤纸、印记膜均须在转膜液中浸泡平衡1-2分钟，方可进行组装。
2)用胶铲轻轻撬开玻璃板，切除浓缩胶，留下分离胶备用。
3)组装：在转膜夹黑色板上，按以下顺序逐层叠加：海绵，滤纸（薄滤纸用3层），蛋白胶，膜，滤纸（薄滤纸用3层），海绵；合上转膜夹透明板，固定卡好。
每一层叠加时，可滴加少许转膜液，以避免气泡；若滤纸、胶、膜之间有气泡，须用玻璃棒从中间向四周轻轻赶压，去除气泡。
4)转膜：将组装好的转膜夹装入转膜内槽，注意转膜夹黑色面对准内槽黑色面，保证正确电极方向；组装好的内槽放入外槽；外槽中放入冰袋，然后加满转膜液，以不溢出为准。
将外槽置于适量冰水混合物中，合上盖子，接通电源；90V转膜60-90分钟，或100V转膜30-60分钟。
5)转膜结束后，取出冰袋和转膜内槽，回收转膜液；用水清洗内外槽，去除残留转膜液体。
2.膜的封闭✓取出印记膜，须用铅笔做一标记，以区分正反面。
正面：指与蛋白胶接触的面。
✓准备一大小合适的塑料盒子，用于膜的封闭、洗涤。
✓膜的封闭、洗涤、抗体孵育时均须在脱色摇床轻轻摇动。
✓blocking buffer封闭液：用PBST配制的5%脱脂奶粉溶液。
1)盒子中加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜1-2分钟。
2)倒去PBST，加入适量封闭液，轻轻摇动孵育印记膜30分钟。
3.一抗孵育✓一抗稀释液：用PBST配制的5% BSA（牛血清白蛋白）溶液，加入0.02%叠氮钠。
✓用15ml离心管配制一抗5-10ml。
一抗稀释比例参考抗体说明书。
✓稀释后的一抗可反复使用，用后保存于4度。
反复使用时，若发现条带信号减弱，可补加1-2ul抗体原液。
1)裁膜：取出印记膜，用保鲜膜包裹好；参考marker，确定待检测蛋白所在位置；用记号笔和直尺按marker指示，画出裁剪线；用剪刀裁取待检测蛋白所在的膜，用于下游实验操作。
裁取膜须用铅笔做一标记，以区分正反面及区分不同的裁取膜。
2)倒去封闭液，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤裁取的印记膜2-3分钟。
3)用钝头镊子，将印记膜转移到相应的一抗离心管中，室温轻轻摇动孵育印记膜1-2小时；或静置于4度过夜，次日于室温轻轻摇动孵育印记膜30-60分钟。
4.一抗洗涤1)取出印记膜，置于盒子中，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜1分钟。
2)倒去PBST，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜5分钟。
3)重复上述步骤，洗涤5次即可。
5.二抗孵育✓二抗稀释液：用PBST配制的2.5% 脱脂奶粉溶液。
✓用15ml或50ml离心管配制二抗10-20ml。
二抗稀释比例参考抗体说明书。
✓稀释后的二抗，2-3天内可反复使用，用后保存于4度。
1)用钝头镊子，将印记膜转移到相应的二抗离心管中，室温轻轻摇动孵育印记膜1-2小时。
6.二抗洗涤1)取出印记膜，置于盒子中，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜1分钟。
2)倒去PBST，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜5分钟。
3)重复上述步骤，洗涤5次即可。
7.显影成像1)打开成像仪器。
2)配制成像检测用HRP发光底物，具体参考说明书。
3)取一块保鲜膜，平整置于成像仪载物台上。
4)取出印记膜，用滤纸吸干多余水分，正面朝上置于上述保鲜膜上；用移液器均匀滴加底物，参照说明书，进行孵育。
5)孵育结束，成像。
SDS-PAGE蛋白胶配制表常规缓冲液配方✓建议用双蒸水或去离子水配制或稀释。
RIPA 裂解液（强）：50 mM Tris-HCl, pH 8.0，150 mM 氯化钠，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS。
RIPA 裂解液（中）：50 mM Tris-HCl, pH 8.0，150 mM 氯化钠，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠。
RIPA 裂解液（弱）：50 mM Tris-HCl, pH 8.0，150 mM 氯化钠，1% NP-40。
10 X SDS-PAGE running buffer（电泳液/ Tris-Glycine SDS Running Buffer）：1000mL ✓使用时必须稀释成1 X。
配制1000ml需下列试剂：30.3g Tris，144g甘氨酸，10g SDS。
10 X SDS-PAGE transfer buffer（转膜液/ Tris-Glycine transfer Buffer）：1000mL✓使用时必须稀释成1 X，且必须加入20%甲醇。
配制1000ml需下列试剂：30.3g Tris，144g甘氨酸。
10 X PBS：1000ml✓使用时必须稀释成1 X。
配制1000ml需下列试剂：80g氯化钠，2g氯化钾，14.4g Na2HPO4，2.4g KH2PO4 。
PBST：PBS（1 X）加入0.05-0.1% Tween 20。
