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sds page 配置方法

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SDS-PAGE试剂配方

SDS-PAGE试剂配方

SDS—PAGE电泳所用溶液：30 ％聚丙烯酰胺溶液（100 mL)丙烯酰胺（Arc）29 gN,N’—亚甲双丙烯酰胺(Bis） 1 g用双蒸水定容至100mL，过滤备用,4℃存放丙稀酰胺29。

2g,N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0,过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)Tris碱15。

1 g甘氨酸（电泳级) 94 g10 %SDS 50 mL使用时稀释5倍使用2×SDS凝胶加样缓冲液（10mL）0.5 mol/L Tris—Cl (pH 6。

8) 2 mL10%（W/V）SDS 4 mL甘油 2 mLβ—巯基乙醇 1.0 mL（DTT（二硫苏糖醇）0。

31g）溴酚兰0。

02g双蒸水0。

5 mL室温存放备用考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R—250 （G—250）1。

0 g甲醇450 mL冰醋酸100 mLddH2O 450 mL0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95%乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好,但有毒性）甲醇100 mL冰醋酸100 mLddH2O 800 mL医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0。

5：5（V：V：V）SDS—PAGE所需溶液:A液-—30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N—N-甲叉双丙稀酰胺0。

8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7。

0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8。

8:18.17g（9。

09g)Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1。

5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8。

8,定容至100mL（50mL）。

C液-—1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8:12。

1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL （3。

SDS-PAGE自制胶操作规程

SDS-PAGE自制胶操作规程

SDS-PAGE自制胶操作规程一：试剂准备SDS-PAGE电泳所用溶液：30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL)丙稀酰胺(Arc)29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g，加入去离子水定容至100mL，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

将商品用的40 %聚丙烯酰胺溶液稀释到浓度为30 %，冰箱4℃保存。

分离胶缓冲液1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：23.23gTirs碱，溶于80mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至8.8，定容至150mL。

浓缩胶缓冲液0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8： 6.0gTirs碱，溶于60mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL。

10％SDS：2gSDS溶于去离子水中，定容至20mL，加热至68℃助溶。

10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，溶于1mL去离子水中；现配现用或分装冷冻备用。

TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。

1×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)Tris碱 3.03甘氨酸(电泳级) 14.4gSDS 1g2×SDS凝胶还原型加样缓冲液(5mL)0.25 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 1 mLSDS 0.25g甘油0.189gβ-巯基乙醇 2.5ml(DTT（二硫苏糖醇）0.385g溴酚兰0.001g双蒸水定容到5ml考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 1.0g甲醇450 mL冰醋酸100 mLddH2O 450 mL考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）450mL乙醇（甲醇）450mL冰醋酸100mLddH2O 450mLPH7.4PBS（0.01M）1LKH2PO4 1 mLNa2HPO40.25gNaCl 0.189gKCl 2.5ml二：凝胶配置1 2 3 41．将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。

玻璃板应保持干燥洁净。

SDS-PAGE所有详细试剂配方

SDS-PAGE所有详细试剂配方

SDSPAGE之迟辟智美创作30%聚丙烯酰胺溶液30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充沛搅拌溶解，补加水至终体积为100ml.0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管.严格核实PH不得超越7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的.使用期不得超越两个月，隔几个月须重新配制.如有沉淀，可以过滤.【保管条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性.称量丙烯酰胺和N,N’亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具.可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎把持，因为它还可能含有少量未聚合资料.1MTrisHCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTrisHCL【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充沛搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4年夜约0.7mL，7.6年夜约0.6mL，8.0年夜约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保管.应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变动不同很年夜，温度每升高1℃，溶液的pH值年夜约降低0.03个单元.【保管条件】室温保管.【注意事项】对人体有安慰性，请注意适当防护.1.5MTrisHCL（pH8.8）(分离胶buffer)【配制方法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充沛搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保管.（1.5mmol/LTrisHCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积.过滤后40C保管.）【保管条件】室温保管【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变动不同很年夜，温度每升高1℃，溶液的pH值年夜约降低0.03个单元.10%十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS【组分浓度】10%(w/v)SDS【配制方法】称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保管【保管条件】室温保管【注意事项】保管条件： 4℃保管. 注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护.易挥发，使用后请盖紧瓶盖. 为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套把持.保管条件： 4℃保管. 注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护.易挥发，使用后请盖紧瓶盖. 为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套对人体有害，请注意防护.10%过硫酸铵溶液10%(w/v)AP【组分浓度】10%(w/v) 过硫酸铵【配制方法】称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水奏乐溶解，4℃保管【保管条件】4℃保管【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4℃保管时，可使用2周左右，超越期限会失去催化作用5×Tris甘氨酸电泳缓冲液 5×TrisGlycine buffer （SDSPAGE 电泳缓冲液）【组分浓度】【配制方法】称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充沛搅拌溶解，定容至1000ml，室温保管.得0.125mol/L Tris1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液.临用前稀释5倍.【保管条件】室温保管，两年有效.【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超越两周.电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用12次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液.5×SDSPAGE加样缓冲液 5×SDSPAGE Loading Buffer【组分浓度】0.25MTrisHCL(pH6.8)；10%(W/V)SDS；0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝)；50%(V/V) 甘油；5%(W/V)β巯基乙醇(2ME)【配制方法】量取 1.25mL 1MTrisHCL（pH6.8），0.5g SDS，25mg BPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保管.使用前将25μL的2ME加入到每小份中.加入2ME的Loading Buffer可在室温下保管一个月左右.【保管条件】20℃保管，至少一年有效.【注意事项】SDSPAGE卵白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇，有轻微安慰性气味，必需完全溶解后再使用.摘自Takara 商品目录实验室惯例试剂配制方法TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R250染色液【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇。

sdspage电泳试剂配制

sdspage电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL；4) 4⨯分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL；5) 4⨯浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL；6) 10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL；7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；8) 2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL；9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4⨯分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4⨯浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。

Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。

SDS-PAGE电泳相关溶液的配置

SDS-PAGE电泳相关溶液的配置

电泳相关溶液的配置：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。

2、5×SDS电极缓冲液：称取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g 加dH2O定容至1000ml。

3、2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl （pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。

4、染色液的配制（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml锥形瓶中，用蒸馏水加以补足至1000ml。

加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。

充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。

当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。

5、脱色液（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。

收集液的SDS-PAGE分析：1、取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。

分离胶配方Resolving Gel (10ml)6%8%10%12%15%H2O 5.4 4.7 4.1 3.4 2.430% acrylamide mix 2.0 2.7 3.3454x resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.520% SDS0.050.050.050.050.0520% APS0.050.050.050.050.05TEMED0.0080.0060.0040.0040.004浓缩胶配方（10ml）H2O 6.9 ml30% acrylamide mix 1.7 ml8x stacking-gel buffer1.25 ml20% SDS0.05 ml20% APS0.05 mlTEMED0.01 ml2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。

SDSPAGE所有详细试剂配方精修订

SDSPAGE所有详细试剂配方精修订

SDSPAGE所有详细试■ 剂配方SANY 标准化小组#QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN# 称S181.7gTrisfi«溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解.加浓HCL调节所需耍的pH值=8・&将洛液定容至ILt 高温高压灭菌后.室温保存。

(1. 5mmol/LTris"HCL(pH8. 8) : 18. 15gTris 和48mllmol/LHCL 混合.加水稀释到100ml 终体积。

过滤后4七保存。

)【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，I大I为Tris溶液的pH值随温度的变化差界很大.温度每升商1°C,溶液称取2g高纯度的SDS迓于100、200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水.689加热溶解.滴加浓盐酸调节PH 至7・2・定容至20ml后，室温保存【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害•请注总:防护。

io%过硫酸鞍溶液------ io%(w G AP称取O・lg过硫酸钱宜于l・5ml离心管•加ImL去离子水吹打溶解.JC保存【保存条件】49保存【注意事项】10%过疏酸钱溶液在49保存时•可使用2周左右•超过期限会失去催化作用5XTris-酸电泳缓冲液------------ oXTris-Clycinebuffer (SDS-PAGE 电泳缓冲液)【组分浓度】称取15. IgTris, 91. 0g甘氮酸(glycine) , 5. OgSDS,用800ml蒸馅水或去离子水溶解.充分搅拌溶解•定容至1000ml,室温保存。

得0・125mol/LTris7 25mol/L甘氨酸电极缓冲液。

临用前稀释5倍。

【保存条件】室温保存•两年有效。

【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。

电泳缓冲液可以回收.回收后可再使用「2次.但为了取得最佳的电泳效果,应使用新电泳液°0. 25MTris-HCL (pH6. 8)：10%(W/V)SDS：0. 5%(W/V)BPB(^酚蓝):50%(V/V)廿油：5%(W/V) 0-筑基乙醇(2-ME)【配制方法】fit取1.25mLlMTris-HCL (pH6・8) , 0・5gSDS, 25mgBPB・2・5mL甘油,宜于lOmL塑料离心管中■加去离子水溶解后•定容至5mL,小份(0・5mL/份)分装，于室温保存。

蛋白sds-page凝胶配方及制胶

蛋白sds-page凝胶配方及制胶
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质电泳技术，用于分离和定量蛋白质。

以下是制作SDS-PAGE凝胶的基本配方和制胶步骤：
配方：
1. 1%丙烯酰胺（Acrylamide）溶液：将3.7g丙烯酰胺和60μl N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解在0.5ml双蒸水中，搅拌均匀。

2. 2.5%BT(Bis-Tris）溶液：将0.1g BT和0.25ml TBE(三酸乙酸盐电泳缓冲液)混合均匀。

3. 10%过硫酸铵（AMS）溶液：将10μl AMS溶解在1ml双蒸水中。

4. 5xTBE电泳缓冲液。

制胶步骤：
1. 将电冰板预热至30℃。

2. 将1%丙烯酰胺溶液和2.5%BT溶液混合，100V恒压电泳10-15分钟，直至胶液凝固。

3. 将胶板取出，放入考马士亮蓝R-250中染色约2小时，然后用自来水冲洗至背景无色。

4. 将胶板再次放入考马士亮蓝R-250中染色约2小时，然后用自来水冲洗至背景无色。

5. 将胶板放入考马士固蓝R-250中染色约2小时，然后用自来水冲洗至背景无色。

6. 将胶板干燥后，即可用于蛋白质电泳。

SDS-PAGE全部试剂配方

SDS-PAGE试剂配方30%凝胶贮液（150ml， 4℃保存）29.2% Acr：43.8g 0.8% Bis：1.2g将Acr完全溶解于120ml水中，再加入Bis使其完全溶解，加ddH2O定容至150ml，用滤纸过滤溶液，棕色玻璃瓶中4℃保存。

分离胶Buffer （1.5M Tris-HCl 250ml）Tris：45.4725g SDS：1g将Tris溶于200ml水中，在磁力搅拌器上不断搅动溶液使其完全溶解，用HCl调节pH 至8.8，此过程中加入HCl时浓度需逐渐降低，越接近目标pH越要小心防止pH调节过头。

加ddH2O定容至250ml，加入SDS（此时容易产生气泡，可用超声或抽气破碎气泡），抽滤或滤纸过滤，4℃保存。

浓缩胶Buffer （0.5M Tris-HCl 100ml）Tris：6.07g SDS：0.4g将Tris溶于80ml水中，后续步骤同分离胶Buffer，调节pH值至6.8（可配置200ml调pH后100ml用于添加SDS作浓缩胶Buffer，剩余100ml为Tris-HCl贮液）SDS裂解液（10ml）：0.5M Tris-HCl pH：6.8 2ml2%甘油2ml4%SDS 0.4g65mM DTT 100mg（使用时临时加入）ddH2O 6ml样品溶解液：（100ml）终浓度为50 mmol/L Tris﹒HClpH=6.8（总体积的20%=20ml），2% SDS=2g，0.1% 溴酚蓝=0.1g，10% 甘油=10ml，补ddH2O到100ml10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL 离心％过硫酸铵：管中冷冻备用TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存（有毒，致癌物质）。

SDSPAGE所有详细试剂配方

SDSPAGE所有详细试剂配方SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用于蛋白质分析的实验技术。

该技术通常涉及到几种试剂，如胶溶液、缓冲液、电泳缓冲液、染色溶液等。

下面是SDS-常见的试剂配方及其详细说明。

一、胶溶液配方：1. 30%（w/v）丙烯酰胺（acrylamide）溶液- 在称量瓶中称取30g丙烯酰胺，并用蒸馏水调至100ml。

搅拌溶解直至均匀。

-这是制备聚丙烯酰胺凝胶的基础溶液。

2. 响应稀释液（Response diluent）-用于稀释聚丙烯酰胺溶液以获得不同浓度的凝胶。

-可通过将聚丙烯酰胺溶液与水按1:3体积比混合来制备响应稀释液。

二、缓冲液配方：1. 离子化追踪剂（Tris-Glycine running buffer）-用于凝胶电泳盒中电解质的运行。

-配方为：3g Tris base （pH 8.8）14.4g glycine将固体溶解于1L蒸馏水中，并调整pH至8.8三、电泳缓冲液配方：1. 离子化追踪剂（Tris-Glycine SDS running buffer）-用于在电泳过程中提供离子追踪剂。

-配方为：30g Tris base144g glycine10gSDS将固体溶解于1L蒸馏水中。

2. 加速剂（stacking gel buffer）- 用于形成凝胶中的聚集堆积层（stacking layer）。

-配方为：30g Tris base （pH 6.8）144g glycine1gSDS将固体溶解于1L蒸馏水中，并调整pH至6.8四、样品处理缓冲液配方：1. 样品加载缓冲液（sample loading buffer）-用于处理蛋白样品，以便在凝胶上获得良好的分离效果。

-配方为：0.5M Tris-HCl（pH 6.8）20%（v/v）甘油10%（w/v）SDS0.05%（w/v）溴酚蓝（bromophenol blue）旋转混合并加入蛋白样品。

五、凝胶染色溶液配方：1. 吸附性染色剂（Coomassie blue staining solution）-用于染色聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质。

SDSPAGE凝胶配方及制胶

SDS-PAGE 凝胶配方及制胶12%分离胶试剂5ml 8ml 10ml 15ml 25ml30ml 60ml 90ml 120ml 30%Acr-Bis （ml ） 2 3.2 4610122436 48 1.5M Tris-HCl PH8.8（ml ） 1.25 2 2.5 3.75 6.25 7.5 15 22.5 30 ddH2O （ml ） 1.65 2.64 3.3 4.95 8.25 9.9 19.8 29.7 39.6 10%SDS （ul ） 50 80 100 150 250 300 600 900 1200 10%APS （ul ） 50 80100 150 250300 600 900 1200 TEMED （ul ） 3 4.8 6 9 15 18 36 54 725%浓缩胶试剂4ml 6ml 8ml 12ml 16ml 20ml 24ml 36ml 48ml 30%Acr-Bis （ml ） 0.66 0.99 1.32 1.98 2.64 3.3 3.96 5.94 7.92 1M Tris-HCl PH6.8（ml ） 0.5 0.75 1 1.5 22.5 34.56ddH2O （ml ） 2.74 4.14 5.48 8.28 11.02 13.7 16.56 24.84 33.12 10%SDS （ul ） 40 60 80 120 160 200 240 360 480 10%APS （ul ） 40 60 80 120 160 200 240 360 480 TEMED （ul ）4681216202436481、按顺序加溶液，每加完一个溶液摇匀一下。

2、TEMED 要在通风橱中加，加入后混匀30秒左右后再注胶；吸打时枪头不出液面，以减少气泡3、分离胶配好后要用水封顶，聚合至少40min （也可聚合一夜）4、加入浓缩胶后插梳子（要洗干净），梳子倾斜插入，避免产生气泡。

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1mM EDTA, pH8.0。
实验步骤：
1、准备 SDS-PAGE 凝胶 [1]. 按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。 [2]. 装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。 [3]. 确定凝胶浓度体积，按表12-2配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯配制。 [4]. 小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到足够高度。 注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1 cm。）。 [5]. 轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝 胶聚合的抑制作用。 [6]. 凝胶充分聚合。时间约30~60min, 聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。 [7]. 倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液 体。 [8]. 按表12-3配制浓缩胶，并注入分离胶上端。插入梳子。插入梳子子应小心避免梳子顶 端留有气泡。
[4]. 10 % SDS（十二烷基硫酸钠）(电泳级)：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至 100ml，室
温保存。 [5]. 10% 过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵溶解于 1ml 双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解，应每周
新鲜配制。 [6]. TEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙二胺）： 原液使用。应使用电泳级 TEMED。 [7]. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mM Tris，1.25M 甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。
聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAA）凝胶是丙烯酰胺（acrylamide，Acr），在交联剂甲叉双 丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物（图 12-1）。
图 12-1 丙烯酰胺的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基， 过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）和 N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine， TEMED）就是这样的催化诱发系统。聚丙烯酰胺的聚合反应是通过加入过硫酸铵启动的，添加 TEMED 加速聚合反应。过硫酸铵提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基。诱发剂 TEMED 能加速过硫酸铵形成自由基，使丙烯酰胺单体转变为自由基态。被激活的单体和未被激活的单 体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互连 成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。溶液的 pH 对聚合作用是重要的，因为过低 pH 没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝 胶时，在加过硫酸胺之前，混合物必须抽去空气。 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于 SDS 和巯基乙醇作用，使得蛋白质分子中二硫键还 原，氨键、疏水键打开，SDS 按 l.4g SDS/1g 蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成 SDS-多肽复合物。因十二烷基磺酸根带负电，使各种 SDS-多肽复合物都带有相同密度的负电荷。
配制方法： 在 900 ml 去离子水中溶解 15.1g Tris 碱和 94 g 甘氨酸（电泳级）（pH8.0）， 然后加入 50 ml 10% SDS（电泳级），用去离子水补至 1000 ml。 [8]. Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM tris，250mM 甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。 [9]. 1×SDS 样品缓冲液：50mM Tris-Cl (pH6.8)，100mM DTT, 2％ (m/v) SDS，0.1％(m/v) 溴酚蓝，10%（v/v）甘油。不含 DTT 的 1×SDS 样品缓冲液可在室温保存。DTT 配 成 1M 的贮存液，临用前加入。 [10]. 2×SDS 上样缓冲液：100mM Tris-HCl (pH6.8)，200mM DTT，4% (m/v) SDS，0.2% 溴 酚蓝，20%甘油。 [11]. 5×SDS 样品缓冲液：250mM Tris-HCl (pH6.8)，500mM DTT，10％ (m/v) SDS，0.5 ％(m/v) 溴酚蓝，50%（v/v）甘油。不含 DTT 的 5×SDS 样品缓冲液可在室温保存。 DTT 配成 1M 的贮存液，临用前加入。 [12]. 蛋白质分子量标准物（marker） [13]. 考马斯亮蓝凝胶染色液：将 0.25 g 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）R-250 溶解 在 90ml 甲醇：水（1：1，v/v）和 10ml 冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存。 [14]. 20% 硝酸银（silver nitrate，AgNO3）溶液：用去离子水配制，棕色瓶室温避光保存。 也可以使用前直接配置：0.625g 硝酸银溶解于 250ml 去离子水中。
凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同 SDS-多肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效应
（图 12-3）。微孔的大小由于 Bis 和 Acr 的比例和凝胶的浓度决定。
表 12-1 列出了凝胶浓度与有效分离范围。
图 12-4 显示了不同浓度聚丙烯酰胺凝胶对同一样品中各蛋白组分的分离效果。
表 12-1 蛋白质在聚丙烯酰胺的有效分离范围
实验 12 蛋白表达的 SDS-PAGE 检测 实验目的：
使学生掌握蛋白质电泳检测常用技术：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以及聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue，R-250）染色技术。同时此实验还要学生掌握如何检测分析蛋白原核表达的状态， 即判断蛋白原核表达部位：培养液（medium部分 （periplasmic fraction）、包涵体部分（insoluble fraction）。 实验原理：
烯酰胺形成的交链增加了凝胶的硬度和韧性，形成了 SDS-多肽混合物通过的孔。这些孔的大小 随着双丙烯酰胺：丙烯酸胺比例的增加而变小，当这个比例达到约 1∶20 时这些孔的孔径达到 最小。大多数 SDS-聚丙烯酰胺凝胶是由一摩尔的双丙烯酰胺与 29 摩尔的丙烯酰胺所组成，这 是一个能够按大小分辨多肽而误差小于 3％的经验比例。这样，凝胶的过滤性质是由孔的大小 而决定的，而这些孔的大小是由加人到凝胶中的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的绝对浓度所决定的。
[15]. 1M IPTG（异丙基硫代-β-D 半乳糖苷）：在 8ml 蒸馏水中溶解 2.383g IPTG 后，用蒸馏 水定容至 10ml，用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存-20℃。
[16]. 10% 三氯乙酸（TCA）：50g TCA 中加入 22.7ml 水，形成的溶液含有 10%（w/v）TCA。 [17]. 细胞裂解液：1mg/ml 溶菌酶（lysozyme）, 20% (m/v) 蔗糖（sucrose）, 30 mM Tris-HCl,
它的量大大超过了蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子问原有
的电荷差别。同时，在水溶液中，SDS-多肽复合物具有近似的形状(长椭圆棒状)，并且不同 SDS多肽复合物的短轴长度趋于一致，而长轴与分子量成正比（图 12-2）。这样。SDS-多肽复合物， 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分 子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系。
表 12-2 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 分离胶配方
凝胶浓度 试剂
不同体积凝胶电泳分离胶所需体积 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 35ml 40ml
H2O
2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5
考马斯亮蓝是一种氨基三苯甲烷染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合物，复合物的形 成可能是范德华力及 NH3+基团的静电作用共同作用的结果。考马斯亮蓝用于聚丙烯酰胺凝胶 电泳后的蛋白质染色，蛋白质对染料的吸附量与蛋白质的量大致成正比，符合比尔-朗勃定律。
目前已经建立了很多用银盐对 SDS-PAGE 分离的多肽染色的方法，基本原理都是利用银离 子结合在氨基酸侧链上之后还原程度的差异。常用的银盐有银铵溶液和硝酸银，检测灵敏度都 高出考马斯亮蓝 R-250 染色 100~1000 倍，且能在一条带上检测出 0.1~1.0ng 的多肽。因硝酸银 溶液更容易配制，且不会产生像银铵盐染色中产生的易爆副产物，实验中应用得更多。
图 12-6 垂直电泳装置及不连续胶的位置、蛋白上样及电泳方向
SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质可通过考马斯亮蓝染色（Coomassie staining）或银染 色（silver staining）在胶上直接显示观察。一块胶可先做考马斯亮蓝染色，之后脱色再进行银染 色。两种染色程序都和蛋白质的质谱分析兼容。或者，蛋白质可以通过电转印（electroblotting） 转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，进行 Western blot 分析（实验 13）。
凝胶浓度（％）
分离范围 （kDa）
15
10~43
12
12~60
10
20~80
7.5
36~94
5.0 Bis: Acr 的分子比为 1∶29
57~212
图 12-4 不同浓度 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同一蛋白样品的结果 (From: )
图 12-5 浓缩胶和分离胶、上样及样品在浓缩胶中的聚集 多数情况下，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的缓冲液系统。在这一系统中，一 般凝胶分为低浓度的浓缩胶（也称“堆积胶或成层胶”）和较高浓度的分离胶 （图 12-5、12-6）。 配制凝胶的缓冲液也有不同的 pH 和离子强度。在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，在移动慢的拖 尾离子（甘氨酸）和移动快的前导离子（氯离子）之间形成了一个界面，这是一个通常根据折 射系数不同而形成的可见的窄窄的条带。移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡 的区域，推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚。当蛋白质样品在浓缩胶中电泳时，蛋白 质富集在前导离子和拖尾离子之间的一个窄窄的条带中，SDS-多肽复合物沿移动的界面迁移， 最终在分离胶表面聚集成一条很细的区带（积层），极大地浓缩了样品的体积，这就是所谓的浓 缩效应（图 12-5）。分离胶 pH 较高，有利于甘氨酸的解离，形成甘氨酸离子穿过堆积的多肽并 紧随氯离子之后，在分离胶中泳动。SDS-多肽复合物从移动界面中解脱开来，在电位和 pH 均 匀的分离胶区段泳动，通过分离胶的分子筛作用按分子大小不同得到分离（图 12-6、12-7、12-8）。