犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性

新疆农业大学学报2011,34(1):59~61Journal of Xinj iang Agricultural U niversity文章编号:1007-8614(2011)01-0059-03犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化陈胜男,马素贞,翟少伦,简子健(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐830052)摘要:为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21(D E3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-P AG E电泳分析证明V P2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathio ne Sepha rose4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。

结果表明,重组质粒E.coli BL21(DE3)在35e,1.0mmol/mL IP T G诱导6h时条件下蛋白表达量最高。

SDS-P AG E电泳检测的纯化目的蛋白约为90kDa,与预计大小一致。

VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。

关键词:犬细小病毒;V P2基因;融合蛋白;优化与纯化中图分类号:S851.659.2文献标识码:AOptimization and Purification of Prokaryotic Expression ofCanine parvovirus VP2GeneCH EN Sheng-nan,M A Su-zhen,ZH AI Shao-lun,JIAN Z-i jian(Colleg e of Anim al M edicine,Xinjiang Ag ricultur al University,U rumqi830052,China) Abstract:In or der to impr ove the expressio n level of Canine p arv ovir us(CPV)VP2gene in Escher ichia coli,optimal conditions for expression level of GST-VP2fusio n protein w er e analy zed by SDS-PAGE at dif-ferent concentratio n,temperature and tim e of employed inducer(IPTG).T he protein w as purified by gluta-thione sephar ose4B affinity column.T he results sho wed that the fusion pr otein ex pr ession of r ecombinant plasmid Escher ichia coli,BL21(DE3)w as the optimal w hen1.0mmo l/mL IPT G w ere induced for6h at 35e.Fusion protein purified by Glutathio ne Sepharo se4B affinity column w as about90kDa w hich w ere consistent w ith the ex pected size by SDS-PAGE.T he optim ized expressio n and purificatio n of VP2gene fu-sion protein set the base for study ing sub-unit v accine of CPV.Key words:Canine p ar vov ir us;VP2;fusion protein;optimization and purification犬细小病毒(Canine p avovir us,CPV)属于细小病毒科,细小病毒亚科,细小病毒属[1],于1978年首次发现[2,3]。

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达简子健;马素贞;陈胜男;翟少华;赵森【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2011(048)004【摘要】[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.【总页数】5页(P719-723)【作者】简子健;马素贞;陈胜男;翟少华;赵森【作者单位】新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐,830052【正文语种】中文【中图分类】S858.292;S188+.2【相关文献】1.犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建 [J], 王玉玲;范京惠;边亚娟;张炳丽;唐丽杰;李一经2.IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建 [J], 许信刚;李健强;王笑梅;童光志3.犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达 [J], 简子健;马素贞;申卫红;翟少华;赵森4.共表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因和鸡补体因子C3d基因的真核表达质粒的构建 [J], 周雪媚;佘锐萍;李永清;章振华;王宏俊;王德成;熊金茂5.IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建 [J], 许信刚;李健强;王笑梅;童光志因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

引文格式：李强, 严立恒, 兰景超, 等. 大熊猫源犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA 检测方法的建立[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2023, 38(5): 795−802. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202211064大熊猫源犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA 检测方法的建立*李　强1， 严立恒1， 兰景超2， 邓　英1， 孙珊珊1， 罗　娌2， 史纪强1， 颜其贵1 **(1. 四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2. 成都大熊猫繁育研究基地，四川 成都 610081)摘要: 【目的】建立一种检测大熊猫血清中犬细小病毒 (canine parvovirus ，CPV)抗体的间接酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA)方法。

【方法】以大熊猫源CPV DNA 为模板，利用PCR 扩增VP2基因，再用原核表达系统对VP2基因进行表达，经纯化后的蛋白作为ELISA 包被抗原；制备并纯化兔抗大熊猫IgG ，采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase ，HRP)标记作为间接ELISA 酶标二抗，通过棋盘法确定抗原包被质量浓度及血清稀释度等条件，并评估建立方法与商业试剂盒检测样品结果的符合率。

【结果】原核表达成功获得约70 ku 的VP2蛋白，将其作为间接ELISA 包被抗原，抗原最佳包被质量浓度为2.0 μg/mL ，血清最佳稀释度为1∶400，用该方法进行检测血清样品时OD 450≥0.258为阳性，反之为阴性。

采用建立的ELISA 方法检测大熊猫血清样本阳性率为60.0%，高于商业化检测试剂盒检测的阳性率(52.5%)，两者总符合率达到87.5%。

【结论】本研究首次建立了基于大熊猫源CPV VP2蛋白为抗原、自制HRP 标记兔抗大熊猫IgG 为酶标二抗的间接ELISA 方法，该方法特异性强、灵敏性较高、重复性好，为大熊猫血清中CPV 抗体的检测提供了技术支持。

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化张坤;马丽娟;李刚;黄伟;李伟;贾凤琴【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2009(011)012【摘要】参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,对CPV VP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,获得重组质粒pGM-T-VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a-VP2,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E.coli Rosetta(DE3)中,获得了基因工程菌株E.coilRosetta(CVP2),并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化.结果表明纯化样品中含有87 kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带.E.coil Rosetta(CVP2)以包涵体形式表达出了CPV-YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础.【总页数】6页(P46-51)【作者】张坤;马丽娟;李刚;黄伟;李伟;贾凤琴【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;西南大学动物科技学院,重庆,北碚,400715;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094;西南大学动物科技学院,重庆,北碚,400715;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094【正文语种】中文【相关文献】1.犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析 [J], 颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华2.犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化 [J], 陈胜男;马素贞;翟少伦;简子健3.犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析 [J], 唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清4.犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析 [J], 卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平5.犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立 [J], 李慕瑶;姜骞;刘家森;司昌德;韩凌霞;曲连东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析曾妮;李刚;朱鸿飞;侯绍华;史利军【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)004【摘要】本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因.扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(+),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确.重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE 及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku.将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合.【总页数】4页(P185-188)【作者】曾妮;李刚;朱鸿飞;侯绍华;史利军【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2【相关文献】1.犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建 [J], 王玉玲;范京惠;边亚娟;张炳丽;唐丽杰;李一经2.犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析 [J], 赵屹钦;曾梦颖;郭娟;张迪;高洪;严玉霖3.犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析 [J], 温峰琴;项海涛;郝宝成;邢小勇;包世俊;胡永浩4.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【摘要】试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础.从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体.序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80％,CPV-2b型占20％.本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低.Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性.该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】9页(P870-878)【关键词】犬细小病毒;VP2;基因型;原核表达【作者】卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;廊坊市动物疾病预防控制中心,廊坊065000;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q785犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性传染病[1]，临床上以急性出血性肠炎、呕吐为主要特征[2]。