犬细小病毒VP2基因

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犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

１０ｍｌｍＬＩＴ诱导６ｈ时条件下蛋白表达量最高。ＳＳＰＧＥ电泳检测的纯化目的蛋白约为９Ｄ，预．ｍｏ／ＧＰＤ－Ａ０ｋａ与计大小一致。ＶＰ２基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。关键词：犬细小病毒；２基因；合蛋白；化与纯化ＶＰ融优
犬细小病毒ＶＰ２基因原核表达条件优化与蛋白纯化
陈胜男，素贞，翟少伦，子健马简
（疆农业大学动物医学学院，鲁木齐新乌８０５）３０２
摘
要：为了提高犬细小病毒ＶＰ２基因在大肠杆菌Ｅ．ｃｌＢＬ１（ｏｉ２ＤＥ３中的表达量，过改变诱导温度、导时）通诱
ｐａｍｉｃｅｉｈａｃｌ，Ｌ２ＤＥ３ｌｓｄＥｓｈｒｃｉｏｉＢ１（）ｗａｈｐｉａｅ．ｍｍｏ／ＰＴＧｒｎｕｅｏｔｓｔｅｏｔ１ｗｈｎ１０ｍｌｍＬＩｗｅｅｉｄｃｄｆｒ６ｈａ
３ ℃．５ＦｕｓｏｏｅｎｐｕｉｉｄｂｙＧｌｔｔｏｐｒｓＢｆｉｉｙｃｌｍｎｗａｂｏｕＤａｗｈｃｒｉｎｐｒｔｉｒｆｅｕａｈｉｎｅＳｅｈａｏｅ４ａｆｎｔｏｕｓａｔ９０ｋｉｈｗｅｅ
ｓｏｏｅｎｓｔｔｅｂｓｏｔｙｎｇｓ — ｎｉａｃｎｆＣＰＶ．ｉｎｐｒｔｉｅｈｙｗｏｒｓＣａｎｎｄ：ｉｅｐａｒｖｉｕｓ；ＶＰ２；ｆｉｎｐｒｔｉｏｔｍｉａｉｎｒｆｃｔｏｖｏｒｕｓｏｏｅｎ；ｐｉｚｔｏｎａｄｐｕｉｉａｉｎ

犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析

ＡｓａｔＡｓａｎｏａｉｅｐｒｏｉｓＣＶ）ａｓｌｅｒｍｂｏｄｅｅｆａｌｐｐｙｓｓｅｔｆｂｔｃ：ｔｉｆｃｎｎａｖｖｒ（Ｐｗｓｉａｄｆｌｙｆｃｓｏｎｉｕｐｕｐｃｅｏｒｒｕｏｔｏｏｌｄｐｒｏｉｓｉｅｔｎｅｉｇｈｔｉ，ｄｓｎｔｄａＰａｖｖｕｆｃｏｓｉＢｉｎ．ＴｅｓａｒｎｉｎｊｒｎｅｉａｓＣＶ—ＤｗｓｉｌｅｙｉｏｕａｉｇＣＦｅｓｎｇｅＤ，ａｏｔｄｂｃｌｔＲＫｃｌｓａｎｎｌｉ
ｓｎｈｏｉｍｎａｄｎｉｅｓｓｒｔｐＰ一２ｙＰＲ，ｔｅＨＡ，ＩＡ，ｌｃｒｎｍｉｒｓｏｙｏｓｒａｉｎａｄｙｃｒｎｓａｄｗｓｉｅｔｄａｅｏｙｅＣＶｉｆａｂＣｈＦｅｅｔｃｏｃｐｂｅｖｔｎｏｏ
［关键词］犬细小病毒；Ｐ；Ｖ２分离；鉴定
ＩｏａｉｎｎｄｎｉｃｔｏｆＣａｉｒｏｉｕｓＤＤｔａｎｎｄｓｌｔｏａｄＩｅｔｆａｉｎｏｎｎｅＰａｖｖｒｉＳｒｉａ
ＳｑｅｃａｙｉｆｔｅＶＰｎｅｕｎｅＡｎｌｓｓｏ２Ｇｅｅｈ
ｓｑｅｃｎｆ２ｇｎ．ＡｕｉｕｌｅｕｎｉｇｏＶＰｅｅｎｑｅＩｅ一３４ｉ２ｏ２ｎＶＰｆＤＤｓａｎｗａｕｄ，ｃｎｒｓｎｒｔｉｓｆｎｒｏｏｔｔｇｔａＴｙ一３４ｉｅＶＰａｉｏ２ｎｔ２ｈ

犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定

多地方开始流行，并由现在的ＣＰＶ２ｃ、ＣＰＶＮｅｗ２ａ和ＣＰＶＮｅｗ２ｂ逐渐替代了原来的ＣＰＶ２、ＣＰＶ２ａ、ＣＰＶ２ｂ，目前ＣＰＶ２ｃ在中国的吉林、北京、山东、河南、广西和江苏已有报道［７１３］。ＣＰＶ基因组全长５２００ｎｔ，包括３个结构蛋白（ＶＰ１、ＶＰ２和ＶＰ３）和２个非结构蛋白（ＮＳ１和ＮＳ２），其中ＶＰ２是该病毒的主要抗原蛋白，占整个衣壳蛋白的９０％［１４］。该病毒自发现至今只有１个血清型，但随着病毒的演变从发现至今共出现了６个抗２ｂ、ＣＰＶ２ｃ、ＮｅｗＣＰＶ２ａ、ＮｅｗＣＰＶ２ｂ，并且不同毒株之间的抗原性也略有差异。［１５１８］
本研究在对ＶＰ２基因进行分析的基础上，对鉴定为ＮｅｗＣＰＶ２ａ的北京毒株进行分离和病毒相关特性鉴定，有助于了解和掌握目前ＣＰＶ的流行情况，为更好地防控ＣＰＶ提供参考。
１材料与方法
１．１材料１．１．１临床样本临床样品来自北京和山东两地的宠物医院，病犬临床症状为呕吐、腹泻等，临床疑
似为ＣＰＶ感染，同时采集病犬的粪便样品备用。１．１．２细胞与主要试剂Ｆ８１细胞，本实验室保存；ＣＰＶ单克隆抗体，ＩＮＧＥＮＡＳＡ公司产品；ＧｏａｔａｎｔｉＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨｉｇｈｌｙＣｒｏｓｓＡｄｓｏｒｂｅｄＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＩＴＣ（货号Ａ１６０７９），英潍捷基（上海）贸易有限公司产品；２×Ｅｓ犜犪狇ＭａｓｔｅｒＭｉｘ，康为世纪生物制品有限公司产品；粪便基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、ＤＮＡ片段回收试剂盒、Ｔｏｐ１０感受态细胞和细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品；ＤＮＡ标准ＤＬ２０００，ＴａＫａＲａ有限公司产品；ＤＭＥＭ、胎牛血

犬细小病毒VP2基因测序分析

与ＰＣＲ检测结果符合率达７６．９；３个试验毒株之间ＶＰ２基因同源性达９６．５～９７．３，与参考毒株同源
性为９５．２～９６．８；由遗传进化树可见，与国内分离毒株的亲缘性略高于国外分离株。结果表明，ＣＰＶ抗原快速检测试剂盒与ＰＣＲ法符合率较高，３个试验毒株与国内外流行毒株之间差异性不大。关键词：犬细小病毒病；ＶＰ２基因；聚合酶链反应；序列分析
（１．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳５５００２５；２．贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳５５００２５；
３．贵阳市黔灵动物医院，贵州贵阳５５０００４）
摘要：为了解贵阳市犬细小病毒（ＣＰＶ）ＶＰ２基因的遗传变异情况，从贵阳市黔灵动物医院采集经试
ＥＩＩＳＡ检测方法，具有良好的特异性，与常见的犬
病毒性传染病阳性血清无交叉反应，重复性良好，与
为了解贵阳市ＣＰＶＶＰ２基因变异情况，本研究选择ＣＰＶ的ＶＰ２基因作为研究对象，采用ＰＣＲ方
我国，ＣＰＶ一２曾在２０世纪８Ｏ年代早期流行，但
ｌ９８６年后全国范围内主要以ＣＰＶ一２ａ占优势地位。２００９年杜强等Ｌ４用猫肾（Ｆ８１）细胞分离鉴定出一株细小病毒为ＣＰＶ一２ａ亚型。近年来，该病的诊断方法层出不穷，姜骞等＿＿５］利用重组蛋白建立了间接

犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究的开题报告

犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究的开题报告一、研究背景与意义犬科和猫科动物是人类近距离生活的宠物动物，对人类健康具有危害，比如犬瘟热、狂犬病等等。

而细小病毒是引起宠物疾病的重要病原体，犬和猫感染细小病毒后会引起消化道和呼吸道病症，严重时可导致犬、猫死亡。

因此，了解犬科和猫科动物细小病毒的遗传进化，对于防治犬、猫感染疾病具有重要意义。

二、研究目的本研究的目的是通过犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析，探讨其基因型特征以及可能的起源及传播途径。

三、研究方法通过文献调研和实验室测序，收集、比对和分析犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因序列数据，并使用生物信息学工具进行DNA序列的物系和进化树分析，得出遗传演化规律和基因型特征。

四、研究内容1. 犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的收集和比对；2. DNA序列的物系和进化树分析；3. 遗传演化规律分析；4. 基因型特征分析。

五、研究预期结果1. 收集到多个犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因序列数据；2. 通过比对和分析数据，得到细小病毒的物系演化树；3. 发现和分析犬科和猫科动物细小病毒的遗传演化规律和基因型特征。

六、研究难点与解决方案1. 分离株VP2基因序列数据的获取和数据比对的准确性问题；解决方案：对数据源的准确性进行评估，对异常数据进行清理，使用比对软件进行多次比对提高数据的准确性。

2. 如何选择合适的生物信息学工具进行数据分析和处理；解决方案：参考已有研究文献，选择相应工具进行分析和处理，并结合实际情况锤炼。

3. 对犬科和猫科动物细小病毒的遗传进化机制理解不够深入；解决方案：广泛查阅相关研究文献和专家意见，研究原理机制，并创新性地提出自己的见解。

七、研究时间表1. 数据收集和比对（2个月）；2. 生物信息学分析和处理（3个月）；3. 遗传演化规律分析（1个月）；4. 基因型特征分析（1个月）；5. 论文撰写和提交（2个月）。

大理地区犬细小病毒VP2基因变异研究及进化分析

用同步法接种到Ｆ８１细胞中分离、鉴定、培养。收毒后提取基因组ＤＮＡ，并以此为ＰＣＲ模板；根据ＧｅｎｅＢａｎｋ
己发表的犬细小病毒ＶＰ２基因序列设计合成一对引物，进行ＰＣＲ扩增获得ＶＰ２全序列基因ｌ７５５ｂｐ片段，并进行序列测定。利用ＤＮＡＳｔａｒ软件对４株病毒的ＶＰ２基因序列以及氨基酸序列进行分析，与ＧｅｎｅＢａｎｋ上已发表
ห้องสมุดไป่ตู้
的１６株犬细小病毒比较，发现病毒的核苷酸同源性在９７．９％～９９．９％之间，氨基酸同源性在９６．４％～９９．９％之间，
总体同源性在９８％以上，进化树分析显示没有形成明显的ＣＰＶ中国进化分枝，表明ＶＰ２基因变异相对较少。同时分离到的４株ＣＰＶ病毒又遵循２ａ亚型的进化特征，因此确定目前云南大理地区犬细小病毒的流行情况仍
＇１ｒ锄物幸蠡ｌ设
大理地区犬细小病毒ＶＰ２基因变异研究及进化分析
李志敏，丁福先，何秉宁，袁鸿胜，施瑞华（云南省大理州动物疫病预防控制中心，云南大理６７１０００）
摘
要：从云南大理地区发病的松狮犬、德国牧羊犬和博美犬的粪便内和国产疫苗中分离到４株犬细小病毒，
以ＣＰＶ＿２ａ为主。
关键词：犬细小病毒；ＶＰ２基因；变异研究；进化分析
中图分类号：￥８５２．６５９．２文献标识码：Ａ文章编号：１００５．９４４Ｘ（２０１３）１０ — ００７０ — ０４ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ

犬细小病毒河南方城株分离及VP2_基因序列分析

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为了解犬细小病毒的临床流行及变异情况，本研究于河南省方城县采集了8份疑似CPV 感染犬粪便样品，经过PCR 检测、CRFK 细胞增殖培养、透射电镜观察和病毒滴度测定后，对其VP2基因进行序列分析。

结果表明5株分离株为犬细小病毒，病毒滴度分别为10-4.22/0.1 mL （China-HN-01株）、10-3.56/0.1 mL （China-HN-02株）、10-3.78/0.1 mL （China-HN-05株）、10-4.47/0.1 mL （China-HN-06株）、10-4.4/0.1 mL （China-HN-07株）。

VP2基因序列比对和遗传进化树分析结果显示，4株分离株基因型为New CPV-2a ，1株分离株基因型为CPV-2c ，5株分离株与疫苗株的同源性为97.8%~98.7%，与国内外参考毒株的同源性为94.0%~99.0%，4株New CPV-2a 基因型毒株与四川的Canine/China/24/2017株亲缘关系最近，CPV-2c 基因型毒株与蒙古国5-MGL 分离株位于同一分支，与我国河南地区的3株CPV-2c 毒株亲缘关系较远。

对河南方城地区CPV 毒株的分析，为研究CPV 变异株在河南地区的传播和宠物疫病防控提供了理论依据。

关键词：犬细小病毒；分离；VP2基因；进化分析中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）03-0054-08Isolation and Sequence Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus from Fangcheng, HenanLIN Yuting 1,2, ZHAI Qi 2, ZHAI Shaolun 2, LYU Dianhong 2, ZHOU Xiurong 2, JIA Chunling 2, HUO Wei 2,WEN Xiaohui 2, Wei Wenkang 1,2,3(1. College of Animal Science & Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province, Scientific Observation and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640, China; 3. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of AgriculturalSciences, Guangzhou 510640, China)收稿日期：2021-01-11基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0501000）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金（2019KJ119）；广东省农业科学院学科团队建设（201634TD）；广东省农业科学院院长基金（202024）作者简介：林瑜婷，女，硕士研究生，预防兽医学专业；翟颀，男，助理研究员，主要从事动物疫病诊断技术研究通信作者：温肖会，E-mail：*******************；魏文康，E-mail：**************犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析林瑜婷1,2，翟颀2，翟少伦2，吕殿红2，周秀蓉2，贾春玲2，霍玮2，温肖会2，魏文康1,2,3（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州510640；3.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州510640）2023,31(3):54-61Abstract: In order to investigate the prevalence and variation of Canine parvovirus, 8 fecal samples were collected from dogs suspected of CPV infection from Fangcheng county, Henan province. Five CPV isolates were obtained based on PCR ampliﬁ cation, growth on CRFK cells, transmission electron microscopy and virus titration. The TCID 50 titers of these isolates were 10-4.22/0.1 mL (China-HN-01 strain), 10-3.56/0.1 mL (China-HN-02 strain), 10-3.78/0.1 mL (China-HN-05 strain), 10-4.47/0.1 mL (China-HN-06 strain) and 10-4.4/0.1 mL· 55 ·林瑜婷等：犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析第31卷第3期犬细小病毒病是由细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus ）的犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）感染犬只引起的致命性传染病[1]，该病常以出血性肠炎、白细胞含量显著减少、腥臭血便和严重脱水等为主要临床特征，部分表现为突然死亡的急性心肌炎型[2]。

一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析

种优势，尽管不如育肥性能明显。商品肉兔半净膛率和全净膛率分别为５．Ｉ３４５６］．％￣５％，后腿比例高达３．９１％，显
示出较高的产肉能力。在肉品质方面，Ｉ和商品代的熟Ｉ系肉率高于Ｉ，说明保水性好；剪切力值较小，肉较嫩。系
；＾：Ｊ：
ｍ
＾：Ｊ：：Ｊ１
５７。ＩＩ交商品兔在产肉性能上也有一定程度的杂．％ＸＩ杂
装的加工。而皮板品质指标的变异系数均在ｌ％以下，说Ｏ明不同皮张质量的一致性较高。
表３商品兔皮板质量评定结果（ｍ、分）ｃ
６
２１年第１（０１期总第１８）６期
毒，定名为ＢＹ２０。对其ＶＰ基因进行了扩增测序，初Ｊ０６２
步确定为２亚型。对该病毒的遗传特性与演化进行了研ａ
显的细胞病变，病变发生在接种后５ｈ，表现为细胞圆０
山
３２
一
株犬细小病毒的分离及Ｖ２因序列分析Ｐ基
杨龙峰① 李英杰① 艾萍萍① 肖胜南① 韩柳② 焦万亮① 王建芬① 张延光① 刘月焕
（北京市延庆县农业局１２０ ② 北京诚安动物医院 ① ０１０
摘要
⑧ 北京市农林科学院畜牧兽医研究所）
中图分类号：￥５．８２５５６
１７年，犬细小病毒（ａｉｅｐｒｏｉｓＰ同时从９８ｃｎｎａｖｖｒ，ｖ）ｕｃ加拿大（ｈｍｓｎ、澳大利亚（ｌ）Ｔｏｏ等）Ｋｅｙ患肠炎的病犬中分ｌ离获得【。ＣＶ可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使 ‘ Ｐ】白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高，症状与猫泛白细胞减少症相似。本病虽出现的时间不

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【摘要】试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础.从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体.序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80％,CPV-2b型占20％.本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低.Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性.该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】9页(P870-878)【关键词】犬细小病毒;VP2;基因型;原核表达【作者】卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;廊坊市动物疾病预防控制中心,廊坊065000;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q785犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性传染病[1]，临床上以急性出血性肠炎、呕吐为主要特征[2]。

犬细小病毒的分离鉴定、序列分析及VP2基因的融合表达的开题报告

犬细小病毒的分离鉴定、序列分析及VP2基因的融合表达
的开题报告
犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是一种致命性疾病的病毒，它感染犬只
的肠道，导致呕吐、腹泻、脱水等症状，最终可能导致死亡。

为了控制该病毒的传播，需要深入研究其分子生物学特征。

本研究将从分离鉴定、序列分析、VP2基因的融合表达三个方面对犬细小病毒进行研究。

具体内容如下：
1. 分离鉴定
从犬只腹泻、呕吐等症状明显的个体中获取病毒样本，并通过PCR扩增VP2基因，用于后续的序列分析和VP2基因的融合表达。

2. 序列分析
对VP2基因进行序列测定和比较分析，包括构建进化树、计算进化距离等，探究不同地区、不同时间点、不同毒力类型的犬细小病毒之间的基因组变异性、遗传漂变
等特征。

3. VP2基因的融合表达
通过重组DNA技术，将不同地区的VP2基因序列融合，并构建质粒表达载体。

将该载体转染CHO细胞，并利用蛋白印迹等技术对重组VP2蛋白进行鉴定和定量分析，探究其免疫原性和保护性等特征。

本研究将深入探究犬细小病毒的分子生物学特征，为该病毒的防控提供理论基础和技术支持。

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分类号：单位代码：10019 密级：学号：S0*******硕士学位论文北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析和流行病学调查Sequence analysis of VP2 gene and epidemiological survey ofcanine parvovirus in Beijing研究生：宋永奇指导教师：吕艳丽副教授合作指导教师：申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学所在学院：动物医学院2008年 5 月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月摘要犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染是目前危害养犬业的最严重传染病之一。

为了了解CPV的变异情况，本研究在2006-2007年间不同时间采集CPV感染患犬粪便样本20份，经PCR方法从中扩增出了CPV VP2基因，并对该基因进行了序列测定与分析；为了了解本病的流行状况，本研究对临床上常用的CPV检测方法的可靠性进行了评估，并在此基础上对2005-2007年到中国农业大学动物医院诊治的所有有呕吐、腹泻和呕吐或腹泻症状的犬粪便样本的CPV检测结果进行了统计分析，获得如下结果：VP2基因全长1755bp，编码585个氨基酸。

经核苷酸及推导的氨基酸序分析显示，20个样本中，有19个属于CPV-2a，1个为CPV-2b；所有病毒样本VP2的297氨基酸残基位点均发生Ser→Ala的置换；基因型为CPV-2a样本的555氨基酸残基位点均发生IIe→Val的置换。

与经典的CPV-2a/2b参考毒株比较，80.0%（16/20）的样本在324位有Tyr→Ile的置换；样本CPV/BJ005/07和CPV/BJ008/07的139位氨基酸残基由Val置换为Ile；样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226与382位发生置换（Ser→Asn，和Arg→Lys)。

应用DNAStar软件对Ile-139、Asn-226、Ile-324和Lys-382置换进行的抗原表位变化分析表明，这4处氨基酸残基置换都不会改变病毒的抗原表位。

将犬细小病毒抗原检测试剂盒与HA-HI和PCR方法进行了比较：犬细小病毒抗原检测试剂盒与HA-HI法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为100.0%、84.5%、90.8%；与PCR法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为85.3%、96.2%、90.0%。

这表明该试剂盒可以用于CPV 的流行病学调查。

CPV检测数据统计分析显示，2005、2006和2007年度CPV年检出率分别为24.14%、35.73%和25.52%；该病一年均可发生，但以第一和第四季度发病率较高；各年龄犬均可感染，但1-3月龄幼犬易感性最高。

关键词：犬细小病毒（CPV），VP2基因，序列分析，诊断方法，流行病学调查AbstractAt present, canine parvovirus (CPV) infection is one of most severe infectious diseases of domestic dogs. In order to understand the variation of CPV, we in this study amplified by PCR, sequenced and analyzed the VP2 gene of twenty faecal samples collected from dogs infected with CPV at different time from the year 2006 to 2007. In order to understand the epidemic situations of CPV infection, we on the base of evaluation of CPV Ag Test Kit, collected and analyzed the results of CPV detection of all dogs sent to China Agricultural University Animal Hospital from the year of 2005 to 2007, and whose clinical symptoms were vomiting and diarrhea, and vomiting or diarrhea. the results of these tests were as follow:The complete VP2 gene sequence was 1755bp encoding 585 amino acids. Sequence analysis of nucleotide and deduced amino acid residues revealed that nineteen samples were CPV-2a and one CPV-2b among the twenty canine parvovirus. All the samples had an amino acid substitution of residue 297 in VP2, Ser to Ala. nineteen CPV-2a samples studied in this study had substitution (IIe→Val) at residue 555 in VP2. Compared with classical CPV-2a/2b isolates, some samples had new amino acid substitutions: CPV/BJ005/07 and CPV/BJ008/07 at amino acid residue 139 in VP2 was Ile instead of Val; Ile-324 mutants accounted to 80% (16/20). Amino acid substitutions (Ser→Asn and Arg→Lys) of residue 226 and 382 were found in samples of CPV/BJ004/07 and CPV/BJ050/07, respectively. Four radical amino acid substitutions (Ile-139, Asn-226, Ile-324 and Lys-382 ) of VP2 did not change viral epitopes by DNAStar software analysis.The result of CPV detection of CPV Ag Test Kit was compared with those of HA-HI and PCR tests: It showed 100.0%, 84.5% and 90.8%, respectively in relative sensitivity, specificity and overall agreement between CPV Ag Test Kit and HA-HI, and 85.3%, 96.2% and 90.0 %, respectively as in comparison with PCR. The results indicated that CPV Ag Test Kit was a suitable test using in clinic and epidemiological survey.The results of CPV epidemiological survey displayed that the positive ratio of CPV infection was 24.14%, 35.73% and 25.52% in the year of 2005, 2006 and 2007 respectively. CPV infection of domestic dogs could take place through the year, but the highest infection rate was the first and fourth quarters. Domestic dogs of every years of age could be infected with CPV but puppies between 1-3 moths were more susceptivity than others.Key words:Canine parvovirus(CPV), VP2 gene, sequence analysis, diagnostic method, epidemiological survey目录第一章引言 (1)1.1 CPV感染研究进展 (1)1.1.1 病原学 (1)1.1.2 流行病学 (7)1.1.3 诊断方法 (7)1.1.4 预防 (14)1.2 研究意义与研究目标 (16)第二章北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析 (17)2.1 材料 (17)2.2 方法 (17)2.3 结果 (19)2.4 讨论 (28)2.5 小结 (29)第三章犬细小病毒流行病学调查 (30)3.1 CPV抗原检测试剂盒临床应用评估 (30)3.1.1 材料 (30)3.1.2 方法 (31)3.1.3 结果 (33)3.1.4 讨论 (35)3.2 犬细小病毒流行病学调查 (37)3.2.1 材料 (37)3.2.2 方法 (37)3.2.3 结果 (37)3.2.4 讨论 (39)3.3 小结 (40)第四章结论 (41)参考文献 (42)致谢 (48)作者简介 (49)缩略词表缩写英文名称中文名称MVC Minute virus of canine 犬极细小病毒CDV Canine distemper virus 犬瘟热病毒DNA Deoxyribonucleicacid 脱氧核糖核酸pair 碱基对bp baseNS Non-structural-proteins 非结构蛋白protein 衣壳蛋白VP Capsidunit (基因)图距单位mu mapORFs open reading frames 开放阅读框g gram 克mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸acid 多聚腺苷酸Poly(A) PolyadenylicÅ &Aring长度计量单位（1m=1010 Å） kDa kilodalton 千道尔顿CPV-2 Canine parvovirus type 2 犬细小病毒2型CPV-2a Canine parvovirus type 2a 犬细小病毒2a亚型CPV-2b Canine parvovirus type 2b 犬细小病毒2b亚型CPV-2c Canine parvovirus type 2c 犬细小病毒2c亚型virus 猫泛白细胞减少症病毒 FPV Felinepanleukopeniamin minute 分钟ml milliliter 毫升h hour 小时μL microliter 微升M mole/liter 摩尔/升CA V-2 Canine adenovirus type 2 犬腺病毒2型CPIV-2 Canine parainfluenza type 2 犬副流感病毒2型saline 磷酸盐缓冲盐水PBS phosphate-buffereds second 秒kidney(cell line)马-达二氏犬肾(细胞系)canineMDCK Madin-Darbyng nanogram 纳克minutes 转/分钟perr/min revolutionsnm nanometer 纳米MEV Mink enteritis virus 水貂肠炎病毒parvovirus 牛细小病毒BPV BovinePFU plaque forming unit 蚀斑形成单位triphosphates 三磷酸脱氧核苷dNTPs deoxy-ribonucleosideMcAbs monoclonalantibodies 单克隆抗体liter 微摩尔/升μM micromole/liter 毫摩尔/升mM millimole/第一章引言1.1 CPV感染研究进展1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等[1]同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）。