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环介导等温扩增技术（LAMP）检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究Ⅱ陈璐;吾拉木·马木提;张德亭;金一帮【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2014(000)007【摘要】目的：为有效地控制预防流行区犬科动物的棘球绦虫感染情况，建立一种快速检测棘球绦虫感染犬的粪便DNA检测方法-环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification ．LAMP）。
方法针对细粒棘球绦虫线粒体DNA ND2基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物，利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内的其它寄生虫DNA来验证LAMP方法的特异性；将转入ND2基因片段的质粒作为标准阳性对照，并做梯度稀释后同时用 LAMP和 PCR方法进行检测比较两者的敏感性。
此外，将采集的46份犬粪便标本提取DNA ，分别运用LAMP和犬尸体剖检进行感染犬的初步检测评估。
结果 E ．g mtDNA ND2基因的LAMP引物能够鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫这两个相近的种属，并不与其它待检寄生虫发生交叉反应，且最低检测限度为4×101拷贝（灵敏度比普通PCR高出103倍）。
在初步对46份犬粪便DNA检测结果中 ND2 LAMP引物显示出较好的灵敏度和特异度，χ2检验结果该方法与犬尸体剖检方法的诊断效果无统计学差异。
结论本研究初步建立了LAM P 技术检测细粒棘球绦虫感染犬的新方法，在各项特异度、灵敏度和样本检测中展现出较好的效果。
该方法不需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳分析过程，有望成为流行区和基层兽医站细粒棘球绦虫感染犬检测的新方法。
%To control and prevent the Echinococcus in the place ,we established a loop-mediated isothermalamplification (LAMP) assay for rapid detection of Echinococcus species specific DNA from dog faeces .Four primers which recognizing 6 dis-tinct regions on the NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene of Echinococcus granulosus were designed and used for LAMP assay .The specificity of LAMP assay was evaluated using DNA extracted from Echinococcus granulosus , Taenia saginata , and other dog intestinal parasites .In addition ,the sensitivity of LAMP assay was compared with that of conventional PCR using recombinant plasmid carrying Echinococcus granulosus ND2 gene fragment as standard template DNA after 10-fold serial dilution .Furthermore ,we extracted DNA from 46 canine fecal samples collected from endemic areas ,and tested the copro-DNA samples using LAMP and necropsy method .Results showed that E .g ND2 primer sets could differentiate Echinococcus granulosus from Echinococcus multilocularis without cross reaction among other parasites detected .Furthermore ,the LAMP assay with primer sets to the ND2 gene could detect 4 × 101 copies of target gene ,demonstrating 103 times higher sensitivity than that of conventional PCR methods .The LAMP assay with primer set to ND2 gene showed good sensitivity and specificity to detect copro-DNA samples extracted from fecal samples of 46 dogs tested in endemic areas .There was no statistically signifi-cant difference among LAMP and necropsy .In this study ,a sensitive ,specific and rapid copro-DNA detection LAMP assay was developed successfully for diagnosis of dogs infected with Echinococcus granulosus .Due to itsrapidity ,simplicity ,speci-ficity and sensitivity ,the LAMP assay is apromising new tool for rapid detection of dogs infected with Echinococcus spp .dur-ing the field survey or in poor-equipped laboratories .【总页数】5页(P718-722)【作者】陈璐;吾拉木·马木提;张德亭;金一帮【作者单位】温州市人民医院检验科，温州 326000; 新疆医科大学基础医学院自治区病原生物学重点实验室，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学基础医学院自治区病原生物学重点实验室，乌鲁木齐 830054;温州市人民医院检验科，温州 326000;温州市人民医院检验科，温州 326000【正文语种】中文【中图分类】R383.3【相关文献】1.环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究 [J], 陈璐;吾拉木·马木提;陈洁;古力帕丽·麦曼提依明2.环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA) [J], 周冬青;刘成永;王骥;王春颖;张克球;刘加彬;黄海滨;候远沛;成松3.环介导等温扩增(LAMP)技术检测东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的研究[J], 席伟军;陈大福;郭睿;李江红;梁勤;苏晓玲;赵东绪;华启云4.环介导等温扩增(LAMP)技术及其在鸭病病原检测中的应用研究进展 [J], 于新友;李天芝;苗立中5.环介导等温扩增（LAMP）技术及其在鸭病病原检测中的应用研究进展 [J], 于新友;李天芝;苗立中因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒胶体金免疫层析检测法的建立犬细小病毒病(Canine parvovirus disease,CPVD)是上世纪七八十年代所发现的急性传染病,是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)感染所诱发的,临床上主要有出血性肠炎型和心肌炎型2种。
该病传播速度快,发病率和死亡率高,四季均可发生,以春夏居多,给犬业发展造成了巨大的危害,因此,快速、准确的诊断对CPVD的防治至关重要。
本研究旨在建立CPV双抗体夹心ELISA检测和胶体金免疫层析试纸条检测方法,并尝试将生物素-亲和素系统的信号放大作用应用到胶体金免疫层析试纸条上,以提高试纸条检测的灵敏度,为临床快速准确检测和诊断CPV提供依据。
本研究包括以下3个部分内容:一、犬细小病毒单克隆抗体ELISA检测法的建立将实验室制备的4株单克隆抗体进行两两配对,选取读值最高的一对,即包被单克隆抗体3A5(mAb-3A5),用辣根过氧化物酶(HRP)标记mAb-3A5作为酶标二抗建立单克隆抗体夹心ELISA检测法以检测CPV抗原。
优化试验的反应条件:mAb-3A5的最佳包被浓度为4μg/mL,4 ℃被过夜,最佳封闭条件为10%胎牛血清PBS(含0.05%Tween-20)于37。
℃孵育2 h,CPV最佳孵育条件为37 ℃作用1 h,检测抗体HRP-3A5的最佳稀释度为1:2000。
所建立的ELISA检测法特异性试验表明,该法与F81细胞上清、犬腺病毒1型(CAV-1)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)均不发生阳性反应;敏感性试验表明该法可检测到的CPV含量最低限度为102TCID50/mL;重复性试验所获批内和批间变异系数分别为2.7%～6.5%和1%～5%。
用该法同PCR法同时检测52份临床样品,结果具有高度一致性,符和率达100%。
说明本试验建立的单克隆抗体ELISA检测法可用于CPV的临床检测。
二、犬细小病毒单克隆抗体免疫层析试纸条制备在已建立的CPV单克隆抗体夹心ELISA 方法的基础上,用胶体金标记纯化的mAb-3A5,捕获CPV抗原,将纯化的mAb-3A5作为检测抗体,羊抗鼠IgG抗体作为质控抗体,分别包被于硝酸纤维素膜(NC膜)制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸条。
环介导等温扩增技术快速检测猪细小病毒的试验黄书林;付萍;李佳禾;张跃伟;蒋菲;张侃;陈会玲;吴文学【摘要】利用环介导等温核酸扩增技术(LAMP),建立了一种灵敏、特异、快速的猪细小病毒(PPV)检测方法.该方法针对猪细小病毒非结构蛋白(NS-1)基因保守区域设计6条特异引物,在63℃的等温条件下45 min即可完成反应.最低检测限量为10拷贝的PPV目的基因,比常规聚合酶链式反应(PCR)方法敏感100倍,并具有良好的特异性.以钙黄绿素和Mn2+作为荧光指示剂,可快速、直观判定反应结果.通过对149份临床样品进行检测比较,LAMP与PCR检出阳性样本数分别为33份和27份,表明LAMP方法阳性检出率高于PCR.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2011(047)010【总页数】4页(P3-6)【关键词】环介导等温扩增(LAMP);猪细小病毒(PPV);PCR;荧光指示剂【作者】黄书林;付萍;李佳禾;张跃伟;蒋菲;张侃;陈会玲;吴文学【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国牧工商(集团)总公司中牧研究院,北京丰台100070;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）感染引起母猪繁殖障碍的重要病原体之一，主要引起母猪发生流产、死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等。
近年来，猪细小病毒病有上升的趋势，并且该病常常与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒，伪狂犬病病毒等发生混合感染，给养猪业造成巨大的损失［1-2］。
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作为一种新兴的核酸扩增技术［3］，具有高特异性、高敏感性、快速、简便等优点［4-6］。
基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立姜一曈;王昭华;鑫婷;贾红;郭晓宇;朱鸿飞;侯绍华【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2018(040)010【摘要】为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成引物,通过对反应条件的优化,建立了CPV的重组酶聚合酶(RPA)检测方法.该方法在38℃恒温反应15min即可快速、特异性的检测出CPV.特异性试验结果显示,除CPV (BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性;敏感性试验结果显示,以重组质粒pEASY-CPV-VP2为模板,RPA的检测下限为1×101拷贝/μL,其敏感度比普通PCR方法高10倍.利用建立的RPA方法对疑似CPV感染的临床样品的阳性检出率为88％,高于普通PCR的检出率(82％)和胶体金的检出率(76％).本研究建立的CPV RPA检测方法操作简单,反应灵敏,结果确实可靠,适用于CPV的快速检测.【总页数】4页(P926-929)【作者】姜一曈;王昭华;鑫婷;贾红;郭晓宇;朱鸿飞;侯绍华【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪细小病毒重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立 [J], 刘立兵;王建昌;经美;王金凤;袁万哲2.基于重组酶聚合酶扩增技术的犬冠状病毒快速检测方法的建立 [J], 陈坚;张丹琳;马磊;伍妙梨3.单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立 [J], 周红蕾;程淑琴;胡永青;刘静4.副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用 [J], 马超;杨潇含;杨乾坤;杨海涛;张佳;董井泉;高嵩5.基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术的苹果病毒新型快速检测方法 [J], 焦健;郑先波;夏炎;武雪莉;王苗苗;宋春晖;庞宏光;白团辉;宋尚伟;黄松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用陶明江;张祥华;孙明;余恩超;陆家卿;王萍;何后军;邬向东;戴益民【期刊名称】《生物灾害科学》【年(卷),期】2013(036)004【摘要】犬细小病毒病感染是由犬细小病毒（cPv）引起犬只死亡的最重要传染病之一，目前诊断该病的方法主要是胶体金快速检测试板法，虽然检测方法较简便快速，但其敏感性较差。
通过对NCBI网站GenBank发表的CPV-2基因组序列的分析，选择该病毒VP2基因保守序列设计引物，通过对阳性病料扩增及扩增产物测序，与NCBI发表的相关基因对比，同源性在99．8％-100％，成功建立了特异性、灵敏度高的PCR方法，最低只需2．5PgDNA模板。
在对28例可疑CPV 病例检测中，本方法检出25例阳性、3例阴性，阳性率为89．28％；胶体金检测板检测出20例阳性、8例阴性，阳性率为71．42％，证实PCR方法比胶体金检测更敏感。
【总页数】5页(P399-402,416)【作者】陶明江;张祥华;孙明;余恩超;陆家卿;王萍;何后军;邬向东;戴益民【作者单位】江西农业大学动物科学技术学院,江西南昌330045【正文语种】中文【中图分类】S852.655【相关文献】1.犬博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用 [J], 陈意伟;温肖会;朱学良;吕殿红;翟少伦;魏文康2.犬细小病毒病PCR检测方法的建立及应用 [J], 陶明江;张祥华;孙明;余恩超;陆家卿;王萍;何后军;邬向东;戴益民3.猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用 [J], 赵灵燕;徐辉;陈伟杰;王勇;倪柏锋;周彩琴;吴赞;4.猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用 [J], 赵灵燕;徐辉;陈伟杰;王勇;倪柏锋;周彩琴;吴赟竑5.犬诺如病毒RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 马会强;岳华;汤承因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物医学进展，２０１９，４０（３）：２６－３０Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ小反刍兽疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立 收稿日期：２０１７－１０－２６ 基金项目：陕西省重点研发计划项目（２０１８ＺＤＸＭ－ＮＹ－０３９）；陕西省农业科技创新转化项目（ＮＹＫＪ－２０１８－ＹＬ０２）；杨凌示范区农业科技示范推广项目（２０１７－ＴＳ－２３）；西北农林科技大学试验示范站（基地）科技成果推广项目（ＴＧ－ＺＸ２０１７－４３） 作者简介：徐 滢（１９９３－），女，陕西西安人，硕士，主要从事动物病毒分子生物学研究。
△同等贡献作者＊通讯作者徐 滢１△，郝玉青２△，付明哲１，张 琪１，李勤凡１＊，许信刚１＊（１．西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌７１２１００；２．榆林市动物疫病预防控制中心，陕西榆林７１９０００） 摘 要：为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的小反刍兽疫病毒（ＰＰＲＶ）环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法，根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＰＰＲＶ Ｆ基因保守区核苷酸序列为靶序列，设计一组特异性ＬＡＭＰ引物，优化反应条件（时间、温度）和反应体系（ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋、甜菜碱浓度），并进行特异性和灵敏性试验，最后用建立的方法对临床样品ＲＮＡ进行检测。
结果表明，所建立的方法在６５℃时反应４５ｍｉｎ即可获得清晰的梯状条带；扩增物经１０×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ荧光染料染色，紫外线照射之后即可直接判定结果；灵敏性试验表明，该方法能够检出的ＰＰＲＶ核酸的最低浓度为８．６３ｎｇ／ｍＬ，与常规ＲＴ－ＰＣＲ方法相比，灵敏度增高１００倍；该方法特异性良好，与山羊痘病毒（ＧＴＰＶ）、羊支原体（Ｍｃｃｐ）、羊口疮病毒（ＯＲＦＶ）均无交叉反应；对１６份临床样品ＲＮＡ检测结果显示，该方法与传统ＲＴ－ＰＣＲ检测结果一致。
建立的ＬＡＭＰ检测方法的特异性、灵敏度均好，可用于临床小反刍兽疫病毒的检测。
关键词：环介导等温扩增；小反刍兽疫病毒；Ｆ基因；检测方法中图分类号：Ｓ８５２．６５文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１９）０３－００２６－０５ 小反刍兽疫（Ｐｅｓｔｅ ｄｅｓ ｐｅｔｉｔｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ，ＰＰＲ）是由小反刍兽疫病毒（Ｐｅｓｔｅ ｄｅｓ ｐｅｔｉｔｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｓｖｉｒｕｓ，ＰＰＲＶ）引起的一种高热稽留、坏死性胃肠炎及重度腹泻，临床症状与牛瘟极其相似的急性、接触性传染病［１］，主要感染山羊、绵羊、野生小型牛科动物，被世界动物卫生组织（ＯＩＥ）列为法定通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
动物医学进展，２０１２，３３（２）：９－１３ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立 温 海 ，秦海斌 ，朱 骞 ，贺星亮 ，陆承平 ，张汇东ｈ （１．公安部南京警犬研究所，江苏南京２１００１２；２．南京农业大学预防兽医学重点实验室，江苏南京２１００９５）
摘 要：旨在建立一种利用环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）检测犬细小病毒感染的新方法。根据Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ中犬细小病毒（ＣＰＶ）ＶＰ２基因序列，设计４条ＬＡＭＰ特异性引物，对反应条件、特异性、敏感性、可视 化效果和应用效果进行研究。结果显示，在６５℃等温条件下、１ ｈ内可完成ＬＡＭＰ扩增过程；病毒的最低检 出限量为１０ 个ＴＣＩＤ 。／ｍＬ；特异性和可视效果良好；对３６份临床标本进行检测，阳性检出率为８０．５ （２９／３６），检出率高于普通ＰＣＲ ７２．２ （２６／３６）。建立的ＬＡＭＰ检测方法，显示了较高的特异性和敏感性， 而且兼具高效、快捷、可视化的优势，为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。 关键词：环介导等温扩增；犬细小病毒；快速检测
中图分类号：￥８５２．６５５；￥８５８．２９２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７ ５０３８（２０１２）０２—０００９—０５ 犬细小病毒病（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）是一 种以肠炎综合征为特征的犬类、猫科和鼬科动物的 急性传染病，由犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ， ＣＰＶ）引起，其较高的发病率和病死率在经济动物、 伴侣动物及军犬和警犬的饲养中造成很大的经济损 失ｌ＿】］。该病主要经由粪便向外排毒，犬感染ＣＰＶ后 ４ ｄ～７ ｄ粪便中病毒滴度即达１０。ＴＣＩＤ 。／ｇ［２］，病 毒在粪便或固体污染物中可存活数月乃至数年，极 易造成该病的群体性暴发。因此，该病的快速诊断对 于及时采取综合防治措施、避免该病的流行至关重要。 环介导等温扩增技术（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ— ｒｅａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是一种新的核酸扩增方 法ｌ＿３ｊ，可在１５ ｍｉｎ ６０ ｍｉｎ内将ＤＮＡ扩增１０。倍
～１０ 倍，效率极高，已建立的不同病原的ＬＡＭＰ方 法 。 都证明了其敏感性为常规ＰＣＲ的１Ｏ倍～１００ 倍，且所需设备简单、反应结果具备良好的可视化效 果，目前已成为病原临床快速诊断的一种新思路。 本文利用环介导等温扩增技术，以粪便作为检测材 料，建立了一种新的诊断犬细小病毒感染的方法，兼具 操作简单、高特异性、高敏感性和高时效性的优势，为 ＣＰＶ的临床诊断提供了一种新颖有效的手段。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 毒株与细胞 犬细小病毒（ＣＰＶ）ＧＮ标准 株、ＣＡＶ Ｉ型ＧＮ株及其细胞培养物，由南京警犬研
究所分离鉴定、培养、保存；３６份粪便或肠内容物等 检测材料，采集自南京及周边地区疑似ＣＰＶ感染 犬；猫肾细胞（Ｆ８１）购自中国兽药监察所。 １．１．２ 试剂 １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液为Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ公司产品；５．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｅｔａｉｎｅ为 Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司产品；ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔａｑ酶为 宝生物工程（大连）有限公司产品。 １．２ 方法 １．２．１ 引物的设计与合成 ＰＣＲ引物根据 ＧｅｎＢａｎｋ参考序列设计，上游引物为Ｐ１：５，＿ＡＴＧ— ＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＧＧ一３ ，下游引物为Ｐ２：５，＿ ＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧ Ｃ一３ ，由南京百龙 基因公司合成，扩增ＣＰＶ ＶＰ２高度保守区域７１８ ｂｐ 的片段。ＬＡＭＰ引物的设计，根据ＣＰＶ ＶＰ２ （Ｍ３８２４５）基因序列，应用在线软件Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ３（ＮｅｔＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｆｕｊｉｔｓｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）设计 能扩增ＶＰ２高度保守区域的引物，引物位置和序列 见表１。 １．２．２ ＬＡＭＰ检测方法的建立 组织样品及细胞 培养物中病毒的ＤＮＡ模板制备按Ｔｒｉｚｏｌ法进行。 ＬＡＭＰ反应总体积２５ Ｌ：内含引物ＣＰＶ—ＢＩＰ和一 ＦＩＰ各１ Ｌ（４０ ｐｍｏ１）、ＣＰＶ—Ｆ３和一Ｂ３各０．５ Ｌ （１０ ｐｍｏ１）、２．５ Ｌ １０×Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｏｌ反应缓冲液 ［２００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣ１， ２Ｏ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍ．ｇＳＯ４，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ ＳＯ４， １０ ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｌ、４．０“Ｌ ５．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｅｔａｉｎｅ、
收稿日期：２０１１－１０—２０ 。 基金项目：公安部应用创新计划（２００７ＹＹＣＸＮＪＪＱＳ１６１） 作者简介：温 海（１９６１一），男，吉林四平人，副研究员，主要从事动物疫病防控工作。＊通讯作者 １０ 动物医学进展２０１２年第３３卷第２期（总第２２４期） ＣＰＶ—ＦＩＰ ＣＰＶ—ＢＩＰ ＣＰ、，＿Ｆ３ ＣＰ、 Ｂ３ ５＇－ＧＴＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣ－ＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＣＧ一３ （Ｆ１ｃ—Ｆ２） ５＇－ＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡ－ＴＧＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＴＧ一３ （ＢＩｃ—Ｂ２） ５ ＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧ一３ ５ ＣＣＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴ一３
４．０ ｕＬ ２．５ ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ ｍｉｘｔｕｒｅ、８ Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉｓｅ、２ Ｌ模板ＤＮＡ。引物和模板在６０、 ６３、６５℃孵育３Ｏ、４５、６Ｏ ｍｉｎ，孵育反应结束后，再在 ８０℃作用１０ ｍｉｎ终止反应。根据反应结果选择合 适的扩增条件。 １．２．３ ＬＡＭＰ特异性鉴定 犬传染性肝炎（ＣＡＶ Ｉ型）是犬的另一种主要病毒性传染病，利用ＣＡＶ Ｉ 型ＧＮ株和ＣＰＶ ＧＮ株细胞培养产物的ＤＮＡ进行 ＬＡＭＰ特异性鉴定，于适宜循环参数下进行ＬＡＭＰ 扩增，判断其特异性。 １．２．４ ＬＡＭＰ敏感性试验 将ＣＰＶ ＧＮ株Ｆ８１ 细胞养产物（病毒含量为ＴＣＩＤ 。一１０／０．１ ｍＬ）进 行１Ｏ倍系列稀释，获得含有１Ｏ。、１０ 、１Ｏ 、１００、 １０～、１０＿。、１０一、１０ 个ＴＣＩＤ 。病毒量的样本，各 取０．１ ｍＬ提取病毒ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应和ＬＡＭＰ 反应的模板，按１．２．２选择的循环参数下进行扩增， 比较ＰＣＲ反应和ＬＡＭＰ反应的敏感性差异。ＰＣＲ 反应总体积２Ｏ Ｌ：２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣＩ２ ２．０ Ｌ，１０ ×ＲＮＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．０ ｕＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６ Ｌ，ＤＥＰＣ—Ｈ２０ １１．５ Ｌ，Ｔａｑ酶 ０．５ Ｌ，样品１．６ Ｌ，１０ ｎｍｏｌ／Ｌ Ｐ１和Ｐ２各 ０．４ Ｌ。ＰＣＲ的反应程序为：９６℃预变性５ ｍｉｎ； ９４℃４５ Ｓ，５５℃４５ Ｓ，７２。Ｃ ４５ Ｓ，３５个循环；７２℃ １０ ｍｉｎ，４℃保存备用。 １．２．５ ＬＡＭＰ结果可视化效果检测 分别以 ＣＰＶ ＧＮ株和蒸馏水作为阳性和阴性对照，对３６份 临床样本在最佳ＬＡＭＰ条件下进行检测，以琼脂糖 凝胶电泳结果为参照，观察ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染色的 可视化效果。琼脂糖凝胶电泳：４ Ｌ ＬＡＭＰ产物， 以１５ ｇ／Ｌ浓度的琼脂糖凝胶电泳，成像、观察。 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染色，按照１：１００的比例向ＬＡＭＰ 反应管中加入ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ，静置观察。 １．２．６ ＬＡＭＰ诊断方法的应用 对３６份疑似 ＣＰＶ感染的病料应用ＬＡＭＰ、ＰＣＲ方法进行检测， 比较两者的符合率和检出率的高低，初步判定ＬＡＭＰ
方法临床使用效果。 ２ 结果 ２．１ ＬＡＭＰ检测方法的建立 以ＣＰＶ ＧＮ株ＤＮＡ为模板，分别以６Ｏ、６３、 ６５℃反应６０ ｍｉｎ，１５ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，显示在 ６５℃时该实验的条带清晰、分辨率较高（图１）。在 ６５℃，分别反应３０、４５、６０ ｍｉｎ，以１５ ｇ／Ｌ琼脂糖凝 胶电泳，表明在４５ ｍｉｎ、６０ ｍｉｎ即可实现扩增，考虑 到产物量与时间的关系，本试验选择６０ ｍｉｎ以提高 反应的灵敏度（图２）。 ２．２ ＬＡＭＰ反应特异性试验 分别以ＣＰＶ ＧＮ株、犬传染性肝炎（ＣＡＶ工型） ＧＮ株和蒸馏水对照ＤＮＡ为模板，在６５℃反应 ６０ ｍｉｎ，产物以１５ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，ＣＰＶ对照 的阳性条带明显，ＣＡＶ工型ＧＮ株和蒸馏水对照均 未出现ＬＡＭＰ特异性条带，表明该方法只能特异检 出ＣＰＶ，对其他犬ＤＮＡ病毒不能检出（图３）。
２ ０００ ｂｐ １ ０００ｂｐ ７５０ ｂｐ
５００ ｂｐ
Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ ２ ０００；１．６５℃；２．６３℃；３．６０。Ｃ Ｍ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００；１．６５℃；２．６３℃；３．６０℃ 图１ ＣＰＶ ＧＮ株的ＬＡＭＰ反应在 不同温度的扩增结果 Ｆｉｇ．１ ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＣＰＶ ＧＮ ｓｔｒａｉｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ １２ 动物医学进展２０１２年第３３卷第２期（总第２２４期） 表２ ＣＰＶ ＬＡＭＰ方法和ＰＣＲ方法的应用比较 Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
３讨论 目前对于ＣＰＤ的诊断，已建立病毒分离培养、 电镜检查、胶乳凝集试验、免疫荧光技术、ＥＬＩＳＡ、 ＨＡ和ＰＣＲｃ 。 等多种检测ＣＰＶ的方法，在一定程 度上满足了ＣＰＶ实验室检测的需要，但在时效性、 灵敏性、便捷性上存在缺陷，有些方法容易出现假阳 性或假阴性结果，无法满足基层现场快速诊断的要 求。本研究建立的快速检测ＣＰＶ病毒的ＬＡＭＰ方 法，可在６５。Ｃ等温的条件下、１ ｈ内完成扩增；与常 规ｐＣＲ相比，检测灵敏度是ＰＣＲ的１００倍；对３６ 份可疑样本的检测证实ＬＡＭＰ阳性检出率高于 ＰＣＲ方法，能有效防止假阴性结果的出现Ｌｌ ，证明 ＬＡＭＰ扩增技术比现有的检测方法更具临床应用 的前景。 ＬＡＭＰ方法的另一个优势是其结果的可视化， 反应产生的大量焦磷酸盐离子在产物中形成白色的 焦磷酸镁沉淀＿１ ，可作为判断ＬＡＭＰ扩增是否发 生的标准；裸眼观察白色沉淀存在一定的误差，添加 溴化乙锭（ＥＢ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、钙黄绿素等染料进 行染色，能够增加可视化反应的灵敏度。本研究在 ＬＡＭＰ扩增产物中加入１ Ｌ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ，阳性产 物在自然光下由橙色转变为绿色，观察效果直观明 显，在临床检测中可替代凝胶电泳，大大增加操作便 捷性和当地操作的可行性。与ＬＡＭＰ方法的高灵 敏度对应，其假阳性是该方法的一个缺陷，尤其是频 繁检测时环境中产生气溶胶污染增加了假阳性的出 现，通过加强操作环境的控制、裸眼观察ＬＡＭＰ产 物的浑浊度进行判定结果、在反应体系中预加羟基 萘酚蓝（ＨＮＢ）［１ ］可有效降低气溶胶污染。另有报 导应用Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ仪来实时监控分析 ＬＡＭＰ反应过程，可以直观、实时地观察反应情况， 能够减低污染因素的干扰ｌ１引，但是仪器造价昂贵， 在当地检测中推广使用较为困难。通过规范操作过 程、增加通风操作、减少开盖检测次数仍然是控制污 染的主要措施。
