犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

昆明犬细小病毒的PCR检测及VP2基因的进化分析苑述友;邱薇;张富强;郑颖;李刚山;刘华;尹革芬;李作生;范泉水【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2010(020)006【摘要】目的自昆明某犬场病死犬心脏扩增犬细小病毒VP2基因并进行测序比对分析,了解其变异和进化情况.方法从病死犬心脏提取病毒DNA进行PCR扩增,PCR阳性产物克隆至pMD18-T载体测序,并与已知参考毒株序列进行比对及系统发育分析.结果 p1p2引物测序与国内外毒株核苷酸同源性在98.0%～100.0%之间,其中与KU739_09最高为100.0%;p3p4引物测序与国内外毒株核苷酸同源性在98.3%～99.6%之间,其中核苷酸同源性与KU739_09、02B9、08 - 5-WH和bj-3最高均为99.6%.系统发育分析表明本次犬细小病毒分离株在CPV-2a亚型的进化分支上.结论从昆明病死幼犬心脏中检测出犬细小病毒,此细小病毒为CPV-2a 亚型,并且和KU739_09、02B9、08-5-WH和bj-3遗传关系比较密切.【总页数】4页(P599-602)【作者】苑述友;邱薇;张富强;郑颖;李刚山;刘华;尹革芬;李作生;范泉水【作者单位】650223,昆明,云南农业大学动物科学技术学院成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所;成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所;成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所;成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所;成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所;650223,昆明,云南农业大学动物科学技术学院;650223,昆明,云南农业大学动物科学技术学院;成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所;成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所【正文语种】中文【中图分类】R446.9【相关文献】1.大理地区犬细小病毒VP2基因变异研究及进化分析 [J], 李志敏;丁福先;何秉宁;袁鸿胜;施瑞华2.犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析 [J], 王洋;胡博;鲁荣光;吕爽;赵辉;廉士珍;闫喜军3.贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析 [J], 陈强;嵇辛勤;段志强;阮涌;雷云;龙丹丹;胡焱;万彪4.南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析 [J], 徐闰;黄华旭;徐小明;李政泰;马麟;劳小香;吴显实5.犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析 [J], 温峰琴;项海涛;郝宝成;邢小勇;包世俊;胡永浩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒VP2基因的克隆与生物信息学分析叶新慧;申魁魁;符欣蕙;王丽霞;李恭贺;张明;卢晟盛;卢克焕;郑喜邦【期刊名称】《基因组学与应用生物学》【年(卷),期】2012(31)6【摘要】本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(Canine parvovirus VP2,CPV-VP2)基因,构建克隆载体pMD18-T-VP2,分析其生物信息学特征。

以犬细小病毒(CPV)阳性病犬血液基因组病毒DNA为模板,PCR扩增CPV-VP2基因,通过TA克隆获得pMD18-T-VP2重组质粒,测序后对其进行生物信息学分析。

结果表明:(1)CPV-VP2完整的开放阅读框由1755个核苷酸组成,共编码585个氨基酸残基,其序列同源性与浣熊最高,达97.6%;(2)信号肽在线预测认为,CPV-VP2基因无信号肽;(3)CPV-VP2大多数氨基酸偏好以T、A结尾的密码子;(4)CPV-VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸分别存在8个、10个和7个磷酸化位点;(5)CPV-VP2可能存在76个B细胞抗原表位;(6)CPV-VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;(7)CPV-VP2蛋白二级结构的α-螺旋区域占9.93%、β-折叠区域占24.49%、无规则卷曲区域占65.58%;(8)CPV-VP2蛋白三级结构存在多个螺旋和折叠区域,主要以无规则卷曲为主。

本研究为制定CPV-VP2基因原核或真核高效表达策略提供了参考资料,并为进一步制备CPV胶体金快速诊断试纸条和基因工程疫苗奠定了基础。

【总页数】5页(P554-558)【关键词】犬细小病毒;VP2基因;分子克隆;生物信息学分析【作者】叶新慧;申魁魁;符欣蕙;王丽霞;李恭贺;张明;卢晟盛;卢克焕;郑喜邦【作者单位】广西大学动物科技学院;亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S858.315.3【相关文献】1.猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析 [J], 罗燕;郭万柱;刘艳丽;殷华平2.成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定 [J], 杨晓农;王成东;项振义;王斌;张焕容;杨发龙;于学辉;龙虎;刘群;陈世界;严玉宝;余华3.南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析 [J], 徐闰;黄华旭;徐小明;李政泰;马麟;劳小香;吴显实4.猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析 [J], 姜伟;郭明佳;吴树康5.猪细小病毒自然弱毒N株VP2基因的克隆、测序及生物信息学分析 [J], 李斌;梁家幸;赵武;苏乾莲;何颖;梁保忠;秦毅斌;何苹萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒JN株的分离鉴定及VP2基因序列分析姜燕霞;张淑玲;王金良;申识川【摘要】本研究从疑似犬细小病毒感染犬粪便中分离鉴定一株犬细小病毒,并进行了VP2基因序列分析.分离株病毒命名为JN株,分离株病毒对猪红细胞的血凝效价为1∶512,Reed-Muench法测定分离株病毒TCID50为10-3.5/0.1 mL,动物回归试验显示攻毒犬能复制出犬细小病毒病的典型临床症状和病理变化,VP2基因序列分析表明该分离株为CPV-2a亚型,与GenBank中的8株CPV VP2基因序列核苷酸同源性在98.7 ％～99.6％之间.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)005【总页数】4页(P83-86)【关键词】犬细小病毒;分离鉴定;VP2基因;序列分析【作者】姜燕霞;张淑玲;王金良;申识川【作者单位】滨州医学院附属医院,山东滨州256603;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;滨州市妇幼保健院,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;湖南省宁远县畜牧水产局,湖南宁远425600【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD）是由犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）引起的犬的一种急性、烈性传染病，该病于1978年在美国首次发现，目前呈世界范围内流行，是危害犬类的最重要传染病之一，每年都给全球养犬业和宠物行业带来了巨大的经济损失［1－5］。

CPV属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus），基因组为单股线状DNA病毒，全长为5.0kb，编码2个结构蛋白（VP1、VP2），其中VP2蛋白是保护性颗粒抗原，可诱导机体产生中和抗体，VP2中的几个关键碱基和氨基酸的变化就可改变病毒的抗原特性和宿主范围［4－6］。

近年来，CPV不断出现新的变异情况，分离鉴定CPV的当地流行毒株以及对结构蛋白VP2基因进行序列分析是了解和掌握CPV变异趋势的主要方法［4.6－7］。

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解犬细小病毒的临床流行及变异情况，本研究于河南省方城县采集了8份疑似CPV 感染犬粪便样品，经过PCR 检测、CRFK 细胞增殖培养、透射电镜观察和病毒滴度测定后，对其VP2基因进行序列分析。

结果表明5株分离株为犬细小病毒，病毒滴度分别为10-4.22/0.1 mL （China-HN-01株）、10-3.56/0.1 mL （China-HN-02株）、10-3.78/0.1 mL （China-HN-05株）、10-4.47/0.1 mL （China-HN-06株）、10-4.4/0.1 mL （China-HN-07株）。

VP2基因序列比对和遗传进化树分析结果显示，4株分离株基因型为New CPV-2a ，1株分离株基因型为CPV-2c ，5株分离株与疫苗株的同源性为97.8%~98.7%，与国内外参考毒株的同源性为94.0%~99.0%，4株New CPV-2a 基因型毒株与四川的Canine/China/24/2017株亲缘关系最近，CPV-2c 基因型毒株与蒙古国5-MGL 分离株位于同一分支，与我国河南地区的3株CPV-2c 毒株亲缘关系较远。

对河南方城地区CPV 毒株的分析，为研究CPV 变异株在河南地区的传播和宠物疫病防控提供了理论依据。

关键词：犬细小病毒；分离；VP2基因；进化分析中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）03-0054-08Isolation and Sequence Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus from Fangcheng, HenanLIN Yuting 1,2, ZHAI Qi 2, ZHAI Shaolun 2, LYU Dianhong 2, ZHOU Xiurong 2, JIA Chunling 2, HUO Wei 2,WEN Xiaohui 2, Wei Wenkang 1,2,3(1. College of Animal Science & Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province, Scientific Observation and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640, China; 3. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of AgriculturalSciences, Guangzhou 510640, China)收稿日期：2021-01-11基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0501000）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金（2019KJ119）；广东省农业科学院学科团队建设（201634TD）；广东省农业科学院院长基金（202024）作者简介：林瑜婷，女，硕士研究生，预防兽医学专业；翟颀，男，助理研究员，主要从事动物疫病诊断技术研究 通信作者：温肖会，E-mail：*******************；魏文康，E-mail：**************犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析林瑜婷1,2，翟 颀2，翟少伦2，吕殿红2，周秀蓉2，贾春玲2，霍 玮2，温肖会2，魏文康1,2,3（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州510640；3.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州510640）2023,31(3):54-61Abstract: In order to investigate the prevalence and variation of Canine parvovirus, 8 fecal samples were collected from dogs suspected of CPV infection from Fangcheng county, Henan province. Five CPV isolates were obtained based on PCR amplifi cation, growth on CRFK cells, transmission electron microscopy and virus titration. The TCID 50 titers of these isolates were 10-4.22/0.1 mL (China-HN-01 strain), 10-3.56/0.1 mL (China-HN-02 strain), 10-3.78/0.1 mL (China-HN-05 strain), 10-4.47/0.1 mL (China-HN-06 strain) and 10-4.4/0.1 mL· 55 ·林瑜婷等：犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析第31卷第3期犬细小病毒病是由细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus ）的犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）感染犬只引起的致命性传染病[1]，该病常以出血性肠炎、白细胞含量显著减少、腥臭血便和严重脱水等为主要临床特征，部分表现为突然死亡的急性心肌炎型[2]。

犬细小病毒VP2基因在枯草芽孢杆菌中的表达及鉴定李爽;黄文斌;黄爱玲;吕暾【摘要】从犬细小病毒/犬瘟热二联苗中提取CPV基因组,根据GenBank发表的CPV-VP2基因序列设计一对引物,对VP2基因进行PCR扩增,并克隆至TA Cloning(R) Kit Dual Promoter( pCRⅡ),获得克隆栽体pCRⅡ-VP2.将重组质粒亚克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pHT43上,获得重组表达栽体pHT43-VP2.经双酶切鉴定及序列比对分析后,将pHT43-VP2载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中进行诱导表达,产物使用PAGE胶蛋白回收法纯化.结果表明,在69 kD处存在目的蛋白,ELISA检测发现,纯化后的目的蛋白与阳性血清存在特异性反应.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】4页(P171-174)【关键词】犬细小病毒;VP2蛋白;枯草芽孢杆菌【作者】李爽;黄文斌;黄爱玲;吕暾【作者单位】福州大学生物科学与工程学院,福州350108;福州大学生物科学与工程学院,福州350108;福州大学生物科学与工程学院,福州350108;福州大学生物科学与工程学院,福州350108【正文语种】中文1977年，美国首先发现犬细小病毒（canine parvovirus，CPV），该病毒属细小病毒科，细小病毒属，为单链DNA病毒[1]。

CPV的感染对象主要是犬，特别是幼犬，具有很强的传染性和较高的死亡率。

此外，CPV一年四季均可发病，且冬、春多发[2]。

该病毒在全球其他地区陆续被发现，并造成严重经济损失，成为对犬类危害最大的传染病之一。

完整的CPV颗粒直径21-24 nm，外观呈六边形，衣壳蛋白无囊膜，不含脂质和糖类[3]。

CPV是最小的DNA病毒，基因组全长仅5 323 bp，Rhode[4]和Reed[5]分别克隆了CPV全基因组，并测定了核苷酸序列。

CPV基因组含有两个开放阅读框架：3'端开放阅读框架编码非结构蛋白NS1和NS2，即早期转录的调节蛋白；5'端开放阅读框架编码结构蛋白VP1和VP2，即晚期转录的病毒衣壳蛋白[6]。

犬细小病毒YBYJ株的分离鉴定及VP2基因的序列分析张立媛;高旭;陈海迪;于清洋;方爽【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)027【摘要】[目的]为分离犬细小病毒(CPV).[方法]采集疑似CPV感染病死犬的组织病料,用胎猫肾细胞(F81)进行病毒分离,并对分离的病毒进行回归动物试验、间接免疫荧光(IFA)及VP2基因PCR扩增鉴定.[结果]经盲传3代后FS1出现明显细胞病变(CPE),分离病毒可导致2～3月龄犬出现典型犬细小病毒病(CP)的临床症状和特征性病理变化,通过IFA观察到特异性的绿色荧光,PCR扩增到VP2基因全长为1 755 bp,编码584个氨基酸.它与国内外具有代表性的18株CPVVP2基因的核苷酸同源性为98.0％～ 99.8％,氨基酸同源性为96.1％～99.8％.[结论]用F81细胞成功分离到1株强毒CPV,命名为YBYJ株.【总页数】4页(P9370-9372,9401)【作者】张立媛;高旭;陈海迪;于清洋;方爽【作者单位】延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133000;延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133000;延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133000;延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133000;延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133000【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5【相关文献】1.犬细小病毒JN株的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 姜燕霞;张淑玲;王金良;申识川2.犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析 [J], 李润;李宁;印春生;薛青红;支海兵3.犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析 [J], 赵屹钦;曾梦颖;郭娟;张迪;高洪;严玉霖4.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【摘要】试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础.从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体.序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80％,CPV-2b型占20％.本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低.Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性.该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】9页(P870-878)【关键词】犬细小病毒;VP2;基因型;原核表达【作者】卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;廊坊市动物疾病预防控制中心,廊坊065000;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q785犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性传染病[1]，临床上以急性出血性肠炎、呕吐为主要特征[2]。

犬细小病毒的分离鉴定、序列分析及VP2基因的融合表达
的开题报告
犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是一种致命性疾病的病毒，它感染犬只
的肠道，导致呕吐、腹泻、脱水等症状，最终可能导致死亡。

为了控制该病毒的传播，需要深入研究其分子生物学特征。

本研究将从分离鉴定、序列分析、VP2基因的融合表达三个方面对犬细小病毒进行研究。

具体内容如下：
1. 分离鉴定
从犬只腹泻、呕吐等症状明显的个体中获取病毒样本，并通过PCR扩增VP2基因，用于后续的序列分析和VP2基因的融合表达。

2. 序列分析
对VP2基因进行序列测定和比较分析，包括构建进化树、计算进化距离等，探究不同地区、不同时间点、不同毒力类型的犬细小病毒之间的基因组变异性、遗传漂变
等特征。

3. VP2基因的融合表达
通过重组DNA技术，将不同地区的VP2基因序列融合，并构建质粒表达载体。

将该载体转染CHO细胞，并利用蛋白印迹等技术对重组VP2蛋白进行鉴定和定量分析，探究其免疫原性和保护性等特征。

本研究将深入探究犬细小病毒的分子生物学特征，为该病毒的防控提供理论基础和技术支持。

犬细小病毒VP2基因序列分析宋永奇;李玉燕;吕艳丽;韩博【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2008(24)7【摘要】2006～2007年间,从中国农业大学动物医院采集的犬细小病毒粪便样本中随机抽取20份,采用PCR技术,扩增了这20份样本的犬细小病毒VP2全基因序列。

经核苷酸及推导的氨基酸序列分析发现,20个样本中,有19个样本属于CPV-2a,1个为CPV-2b,且所有病毒样本的297位均发生Ser→Ala的置换;基因型为CPV-2a病毒样本的555位均发生回归性置换(Ile→Val)。

与经典的CPV-2a/b毒株比较,部分样本还出现了新位点氨基酸置换现象。

其中,样本CPV/BJ005/07与CPV/BJ008/07VP2的139位氨基酸残基由Val置换为Ile;80%(16/20)的样本在324位有Tyr→Ile的置换;样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226(Ser→Asn)与382(Arg→Lys)位发生置换。

运用DNAStar软件对上述置换的氨基酸残基进行综合分析发现,除Ile-139突变意义不大外,Ile-324、Asn-226和Lys-382均处在VP2蛋白潜在的抗原表位区域,有着重要的生物学意义。

【总页数】6页(P26-31)【关键词】犬细小病毒(CPV);PCR;VP2基因;序列分析【作者】宋永奇;李玉燕;吕艳丽;韩博【作者单位】中国农业大学动物医学院【正文语种】中文【中图分类】S3【相关文献】1.犬细小病毒西宁分离株的分子鉴定及VP2基因序列分析 [J], 简莹娜;张学勇;赵海龙;李秀萍;王戈平;刘振伟;王光华;蔡其刚;马利青2.犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析 [J], 赵屹钦;曾梦颖;郭娟;张迪;高洪;严玉霖3.犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定 [J], 周宏专;苏霞;林路路;齐颀;张进;徐福洲;杨兵4.14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析 [J], 李少晗;由欣月;范君文;徐一;郝雲峰;崔尚金;秦彤5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒临床分离株VP 2基因进化分析温峰琴1,项海涛1,郝宝成2,邢小勇1,包世俊1,胡永浩1(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃兰州730050)㊀㊀摘要:为了对犬细小病毒临床分离株的VP 2基因进行遗传变异分析,了解本地区犬细小病毒流行的优势型别及病毒变异情况㊂采集2例患犬细小病毒病的动物粪便,提取病毒基因组,设计特异性引物,PCR 扩增VP 2基因,对扩增产物测序,对序列结果与同属其他毒株VP 2基因序列用MEGA 7和MegAlign 进行同源性分析和遗传进化分析㊂同时比较其氨基酸变异情况㊂结果显示,PCR 扩增出VP 2基因,测序结果显示大小为1755bp,2株病毒VP 2基因NCBI 序列登录号分别为MH155192和MH155193,MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性为99.9%,MH155193与KY937651.1㊁KP260509.1㊁KY937641.1核苷酸同源性为99.8%㊂MH155192主要位点氨基酸分别为为267Y,324I,370Q,426D,440A㊂MH155193主要位点氨基酸分别为267Y,324I,370R,426E,440T㊂且2株病毒297位均为A㊂表明分离到的2株病毒分别为新CPV-2b 和CPV-2c 型㊂关键词:犬细小病毒;VP 2基因;新CPV-2b ;CPV-2c ;序列分析中图分类号:S855.3㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)12004105㊀㊀Evolutionary and Genetic Analysis of Canine Parvovirus VP 2Gene in LanzhouWEN Feng-qin 1,XIANG Hai-tao 1,HAO Bao-cheng 2,XING Xiao-yong 1,BAO Shi-jun 1,HU Yong-hao 1(1.Veterinary Medicine College ,Gansu Agricultural University ,Lanzhou 730070,China ;nzhou Institute of Animal and Veterinary Pharmaceutics Science ,Chinese Academy of Agriculture Science ,Lanzhou 730050,China)Abstract :To analyze the genetic variation of VP 2gene of canine parvovirus clinical isolates and to understand the predominanttypes and virus mutations of canine parvovirus epidemics in this region.The feces of 2dogs with canine parvovirus disease were col-lected and viral DNA were extracted.Then,specific primers were designed to amplify VP 2by PCR,and the amplified products were sequenced.MEGA 7and MegAline were performed for homology analysis and genetic evolution analysis with the VP 2gene sequencesof isolated strains and those of other strains belong to the same genus.At the same time,the amino acid variation was compared.The sequencing result showed that the VP 2gene was 1755bp.The NCBI sequence accession numbers of the two strains were MH155192and MH155193.The nucleotide homology of MH155192with MF467233.1and JQ743891.1was 99.9%.The nucleotide homology of MH155193with KY937651.1,KP260509.1,and KY937641.1was 99.8%.The main amino acids of MH155192were 267Y,324I,370R,426D,440A.The main amino acids of MH155193are 267Y,324I,370Q,426E and 440T,respectively.Both strainswere A at position 297.The two isolates were new CPV-2b and CPV-2c.Key words :Canine parvovirus ;VP 2gene;CPV-2b ;CPV-2c ;Sequence analysis Corresponding author :HU Yong-hao ,E-mail:yhh0817@收稿日期:20180410基金项目:盛彤笙科技创新基金(GSAU-STS-1521);甘肃农业大学动物医学院教研产学支持计划(JYCX-KX014)作者简介:温峰琴(1980),女,讲师,硕士,从事兽医相关工作,E-mail:46292083@通讯作者:胡永浩,E-mail:yhh0817@㊀㊀犬细小病毒感染是由犬细小病毒(Canine par-vovirus,CPV)引起的犬的一种急性传染病,特征为出血性肠炎或非化脓性心肌炎,多发生于幼犬,病死率10%~50%[1]㊂CPV 属于细小病毒科细小病毒亚科的Protopar-vovirus 属,与猫细小病毒(FPV),水貂肠炎病毒(MEV)和浣熊细小病毒(RaPV)均为食肉动物原细小病毒1的变种[2]㊂CPV 是一类结构简单的单链线状DNA 病毒,病毒颗粒直径约为25nm,无囊膜,呈二十面体[3]㊂病毒基因组全长为5323nt,含有2个ORF ,5ᶄ端主要编码早期转录的调节蛋白NS1和NS2,3ᶄ端编码晚期转录的结构蛋白,即病毒衣壳蛋白VP1和VP2,VP2是衣壳蛋白的主要成分,具有较强的免疫原性,可用于制备亚单位疫苗或DNA 疫苗[4]㊂由于犬细小病毒,尤其是VP 2基因容易发生变异,且在同一动物体有时能够检测到几种病毒变体,即共同感染[2],对VP2序列的扩增和分析有助于了解流行毒株的抗原和基因变异情况㊂由于VP2的突变和重组影响宿主范围和受体结合的亲和力,因此对毒株VP2基因的监测有助于了解流行株与疫苗株的关系及CPV的进化模式,本试验对兰州分离的2例犬细小病毒VP2进行遗传进化分析及氨基酸变异分析,为犬细小病毒病的分子流行病学调查及防控提供了数据㊂1㊀材料与方法1.1㊀病料㊀2例犬细小病毒病患病犬粪便均来自兰州某宠物医院,采集时间分别为2017年4月和2017年6月㊂1.2㊀试剂㊀2ˑTaq PCR Master Mix㊁病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒,购自TIANGEN公司;胶回收试剂盒,购自OMEGA公司;DL-2000 DNA Marker,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;pMD19-T Vector,购自TaKaRa公司; IPTG㊁X-gal㊁DH5α,购自北京全式金生物技术有限公司㊂1.3㊀方法1.3.1㊀引物设计㊀参照NCBI数据库犬细小病毒VP2基因保守区设计扩增全长的引物,引物序列包含酶切位点,由金唯智生物科技有限公司合成㊂引物序列如下:VP2-forward:5ᶄATA CATATG AGTGATGGAGCAGTTCAACC3ᶄVP2-reverse:5ᶄTAT GGATCC TTAATATAATTTTCTAGGTG3ᶄ1.3.2㊀病毒基因组DNA提取㊀2017年4月分离的病毒株命名为CPV/canine/LZ/1/2017,2017年7月分离的病毒命名为CPV/canine/LZ/2/2017,按照TIANGEN病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行㊂1.3.3㊀VP2基因的扩增㊀PCR反应体系:2ˑTaq PCR Master Mix25μL,ddH2O23μL,上游引物1μL,下游引物1μL,模板1μL,总体积50μL㊂PCR反应条件:95ħ预变性5min;95ħ1min, 53ħ40s,72ħ90s,30次循环;72ħ10min㊂扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳㊂电泳后切取目的条带,用胶回收试剂盒进行纯化回收㊂1.3.4㊀连接与转化㊀胶回收产物与pMD19-T载体连接㊂连接体系为10μL,其中SolutionI5μL; pMD19-T载体2μL;胶回收产物3μL;16ħ连接30min㊂连接产物转化100μL感受态大肠杆菌DH5α㊂冰浴30min,42ħ热激45s,冰浴2min㊂在上述感受态细胞中加入950μL不含抗生素的LB 液体培养基37ħ震荡培养1h㊂用移液器吸取100μL培养液涂布含有IPTG㊁X-gal和氨苄青霉素的LB平板培养基,37ħ培养12-16h㊂1.3.5㊀阳性重组质粒的鉴定㊀挑取平板中的白斑(阳性)于含氨苄青霉素的LB肉汤中37ħ摇床中培养8h至菌液浑浊;吸取少量菌液进行菌液PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳,观察是否出现目的条带㊂取出现目的条带的菌液1mL,离心,弃上清,送金唯智生物科技有限公司测序㊂1.3.6㊀序列测定与分析:将临床分离株VP2基因序列与NCBI中的24株犬细小病毒及3株猫细小病毒VP2基因序列用MEGA7.0进行比对分析,并绘制遗传进化树㊂用MegAlign软件分析核苷酸同源性,同时分析氨基酸变异情况㊂2㊀结果2.1㊀PCR扩增结果㊀PCR扩增产物大小约为1700bp,与预期一致,如图1所示㊂图1㊀犬细小病毒VP2基因PCR产物电泳1:CPV/canine/LZ/1/2017VP2基因;2:CPV/canine/LZ/2/2017VP2基因;M:DL-2000DNA Marker2.2㊀核苷酸遗传进化及同源性分析㊀测序结果显示,2株病毒VP 2基因大小为1755bp,CPV /canine /LZ /1/2017VP 2基因NCBI 登录号分别为MH155192,CPV /canine /LZ /2/2017VP 2基因MH155193㊂遗传进化分析显示,猫细小病毒和犬细小病毒明显位于不同的进化分支上,MH155192与MF467233.1㊁JQ743891.1和KY937659进化关系较近,位于同一进化分支㊂MH155193与KY937651.1㊁KP260509.1㊁KY937641.1进化关系较近,位于另一独立的进化分支上,如图2所示㊂核苷酸同源性分析显示,MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性最高,均为99.9%,与MG264078.1同源性较低(99%)㊂MH155193与KY937651.1㊁KP260509.1㊁KY937641.1核苷酸同源性均为99.8%,与KF149967.1同源性较低(99.1%),MH155192和MH155193同源性为99.3%,如表1所示㊂图2㊀犬细小病毒临床分离株VP 2基因系统发育树2.3㊀氨基酸变异分析㊀MH155192在易发生变异的位点氨基酸分别为5A,80R,87L,93N,101T,103A,178D,212F,232I,267Y,297A,300G,305Y,322T,323N,324I,370R,373D,426D,440A,564S,568G㊂各毒株之间氨基酸差异明显的位点主要在267㊁324㊁370㊁426㊁440位,如表2所示㊂MH155192和MH155193共有13个核苷酸差异,其中的10个核苷酸的变化仅造成同义突变,而3个核苷酸突变导致氨基酸改变,分别位于370㊁426和440位残基㊂总体来看,在24株犬细小病毒中,中国分离株267位均为Y,324位均为I,与美国㊁厄瓜多尔分离株差异明显,370位中国分离株为Q 或R㊂CPV-2c 分离株440位均为T㊂表1㊀犬细小病毒临床分离株VP2基因同源性分析12345678910111213141516171819 1-99.599.899.599.499.999.799.49999999999.399.399.299.199.199.198.9 20.5-99.599.699.599.499.599.599.299.299.399.299.399.399.399.299.299.299.1 30.20.5-99.499.499.799.799.498.998.99998.999.299.299.199.299.299.198.9 40.50.40.6-99.599.499.599.799.199.199.299.199.599.599.499.499.499.499.2 50.60.50.60.5-99.399.599.49999999999.299.299.199.199.199.198.9 60.10.60.30.60.7-99.599.398.998.998.998.999.199.199.199.1999998.8 70.30.50.30.50.50.5-99.49999999999.399.399.299.399.399.198.9 80.60.50.60.30.60.70.6-99.399.399.399.399.899.899.899.799.799.799.3 910.8 1.10.91 1.110.7-99.999.999.899.399.399.399.299.299.299.8 1010.8 1.10.91 1.110.70.1-99.899.999.399.399.399.299.299.299.8 1110.710.81 1.110.70.10.2-99.799.499.499.399.399.399.399.8 1210.8 1.10.91 1.110.70.20.10.3-99.399.399.399.299.299.299.7 130.70.70.80.50.80.90.70.20.70.70.60.7-10099.999.999.999.999.4 140.70.70.80.50.80.90.70.20.70.70.60.70-99.999.999.999.999.4 150.80.70.90.60.90.90.80.20.70.70.70.70.10.1-99.899.899.899.3 160.90.80.80.60.90.90.70.30.80.80.70.80.10.10.2-99.999.899.3 170.90.80.80.60.910.70.30.80.80.70.80.10.10.20.1-99.899.3 180.90.80.90.60.910.90.30.80.80.70.80.10.10.20.20.2-99.3 19 1.10.9 1.10.8 1.1 1.2 1.10.70.20.20.20.30.60.60.70.70.70.7-注:1,KF149985.1;2,KF149967.1;3,KF149973.1;4,KJ813864.1;5,KJ813850.1;6,MG264078.1;7,MG264076.1;8,KX198141.1; 9,KY937651.1;10,KP260509.1;11,KY937641.1;12,KY937650.1;13,MF467233.1;14,JQ743891.1;15,KY937659.1;16,KU983491.1; 17,GQ379047.1;18,MH155192;19,MH155193表2㊀VP2蛋白氨基酸变异情况序号毒株位置267324370426440基因型宿主时间国家1GQ379047.1Y I Q N A2a犬2009泰国2KF149973.1F Y Q N S2a犬2012厄瓜多尔3KF149985.1F Y Q D S2b犬2012厄瓜多尔4KF149967.1F Y Q E T2c犬2012厄瓜多尔5MG264078.1F Y Q D S2b斗牛犬2017厄瓜多尔6KJ813882.1F Y Q D T2b浣熊2012美国7KJ813881.1F Y Q D T2b灰狼2012美国8KJ813884.1F Y Q E T2c郊狼2012美国9KJ813892.1F Y Q D T2b郊狼2013美国10KJ813835.1F Y Q N T2a渔貂2013美国11KJ813864.1F Y Q D T2b美洲狮2013美国12KJ813850.1F Y Q D T2b短尾猫2013美国13KX198141.1F I Q D A2b犬2016伊拉克14KX618915.1Y I Q N A2a椰子狸2016新加坡15JQ743891.1Y I Q D A2b斗牛犬2010中国16KP260509.1Y I R E T Novel2c犬2014中国17MF467233.1Y I Q D A New2b犬2015中国18KY937641.1Y I R E T2c犬2016中国19KU983491.1Y I Q N A2a犬2016中国20KY937650.1Y I Q E T2c犬2016中国21KY937651.1Y I R E T2c犬2017中国22KY937659.1Y I Q D A2b犬2017中国23MH155192Y I Q D A2b犬2017中国24MH155193Y I R E T2c犬2017中国3　讨论犬细小病毒,为将其与抗原无关的犬科动物微小病毒(MVC或CPV1)区分开来,也称为CPV2,1978年出现在美国,并迅速蔓延在世界各地的狗群中引起居高不下发病率[5]㊂在1979年和1984年,CPV-2a和2b两种新抗原类型分别取代了原来的CPV-2,获得了在猫中高效复制的能力㊂CPV-2a和CPV-2b至少在VP2衣壳蛋白上有5个或6个氨基酸与最初的CPV2不同㊂在CPV-2a和CPV-2b中VP2第297位(SerңAla)的额外氨基酸改变产生了 新CPV-2a 和 新CPV-2b ㊂此外,在2000年报道了另一种抗原变体,其特征在于氨基酸替代426-AspңGlu㊂这种CPV-2c随后在全球范围内被报道,并与严重的临床病程相关,死亡率较高[6]㊂CPV-2a(Met87Leu,Ile101Thr, Ala300Gly,Asp305Tyr,Asn375Asp,和Val555Ile氨基酸变体)和CPV-2b(Asn426Asp),CPV-2c (Asp426Glu)仅有1个氨基酸位置不同(VP2426残基)[7]㊂VP2的426和297位氨基酸在空间上分别接近衣壳表面上三倍体突起的残基97和300㊂结构研究表明,该区域与宿主细胞的转铁蛋白受体(TFR)相互作用以介导感染,限制宿主范围,并且具有很高的抗原性[6]㊂近年来中国分离株CPV-2a, CPV-2b,CPV-2c三种类型都有㊂在本文氨基酸分析的24株病毒中,除KJ813835.1第297位为Ser 外,其余菌株都为Ala,故认为CPV/canine/LZ/1/ 2017和CPV/canine/LZ/2/2017分别是新CPV-2b 和CPV-2c㊂尤其CPV-2c甚至能引起成年犬的严重疾病,应引起重视㊂一般氨基酸替换发生于K80R,K93N, V103A,D323N,N564S和A568G,在本文的氨基酸序列分析中发现,不同毒株之间的主要突变发生在F267Y,Y324I,Q370R,N426D或D426E, T440A㊂这些突变可能会导致病毒通过抗原漂移免疫逃避和随之而来的疫苗失败㊂在非同义突变中,氨基酸残基267未暴露于衣壳表面,因此在这个位置的替代可能不会影响病毒的抗原性㊂Y324I突变常见于亚洲国家特别是中国和南美㊂该突变可能对细小病毒宿主范围有影响,且由于Y324I突变发生在潜在的重要的抗原表位区域,这个替代可能对病毒生物学有直接影响㊂T440A突变对于CPV也很重要,因为残基440位于衣壳表面VP2的3倍体突起的顶部,主要的病毒抗原位点㊂因此导致其他抗原性变体出现[8]㊂台湾CPV-2c毒株VP2蛋白也存在Q370R的替代,突变Q370R在中国的大熊猫和中国的CPV-2c株中观察到㊂370残基位于残基359和375之间(它是衣壳蛋白的表面环),毗邻双Ca2+结合位点,这些对于病毒感染性是必不可少的,这些位点的改变与病毒凝集红细胞的能力相关[9]㊂因此,Q370R变异是否导致抗原变化仍有待调查㊂总的来说,进一步研究犬细小病毒流行毒株的基因变异情况,以及变异引起的生物学特性的变化对于该病的防控有重要意义㊂参考文献:[1]㊀蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社,2001:354[2]㊀Cotmore S F,Mavis A M,Chiorini J A,et al.The family Parvoviri-dae[J].Archives of Virology,2014,159(5):12391247. [3]㊀董江丽,李淑芬,张鹤龄.犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析[J].中国病毒学,2000,15(4): 379387.[4]㊀王微,李秀锦,仲飞,等.犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性[J].微生物学报,2009,49(5): 648652.[5]㊀Giudici S D,Cubeddu T,Giagu A,et al.First molecular charac-terization of canine parvovirus strains in Sardinia,Italy[J].Ar-chives of Virology,2017,162(11):34813486. [6]㊀Vieira F V,Hoffmann D J,Fabri C U F,et al.Circulation of ca-nine parvovirus among dogs living in human-wildlife interface in the Atlantic forest biome,Brazil[J].Heliyon,2017,3(12): e00491.㊀[7]㊀Ahmed N,Riaz A,Zubair Z.et al.Molecular analysis of partialVP-2gene amplified from rectal swab samples of diarrheic dogs in Pakistan confirms the circulation of canine parvovirus genetic vari-ant CPV-2a and detects sequences of feline panleukopenia virus (FPV)[J].Virology Journal,2018,15(1):45.[8]㊀Li G R,Ji S L,Zhai X F,et al.Evolutionary and genetic analysisof the VP2gene of canine parvovirus[J].BMC Genomics,2017, 18(1):534.[9]㊀Lin Y C,Chiang S Y,Wu H Y,et al.Phylodynamic and GeneticDiversity of Canine Parvovirus Type2c in Taiwan[J].Internation-al Journal of Molecular Sciences,2017,18(12):2703.。

48卷第3期Vol.48,No. 3青海畜牧兽医杂志Chinese Qinghai Journal of Animal and Veterinary Sciences1 6/2018犬细小病毒西宁分离株的分子鉴定及VP2基因序列分析简莹娜张学勇赵海龙3,李秀萍王戈平刘振伟王光华蔡其刚马利青1>2*(1.青海省畜牧兽医科学院，西宁，810016; 2.青海大学畜牧兽医科学院省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁，810016; 3.青海省西宁市野生动物园，西宁,810001)摘要:本研究首次对地处青藏高原地区的西宁的犬细小病毒分离株（命名为C P V -X N1)进行了 V P2基因的克 隆、测序,并与我国以及我国周边国家地区的流行株，以及参考株进行了核苷酸同源性比对和进化分析。

V P2基因分子 鉴定结果显示，该分离株为C P V-2b亚型株，V P2基因核苷酸序列全长1755bP，蛋白长度为584个氨基酸，分子量大小 约为64. 58 k D a，V P2蛋白为稳定蛋白，总体亲水性较高，可溶于水，V P2蛋白的二级结构以无规则卷曲为主;V P2基因 的T- B细胞共同表位为序列的97 - 105位点，其序列为A L D D T H A Q I,位点286 - 294，序列为G L P P F L N S L。

西宁分离 株与我国各地区流行株的核苷酸序列同源性和氨基酸同源性均在99%以上;C P V- X N1分离株V P2基因氨基酸序列中 的非同义突变位点有1处，在78位氨基酸处;V P2基因进化树分析发现：C P V - X N1分离株与C P V -2b北京分离株 (K T162024)和C P V-2b兰州分离株（JQ268284)组成一个微小分支，并与其它C P V -2b分离株处于同一个大支上，从 进化角度上鉴定此研究分离株应属C P V-2b株。

因此，本实验对青海西宁C P V- X N1分离株的V P2基因抗原表位分 析和系统进化的探讨结果，有望为我国C P V分子流行病学调查提供一定的数据参考依据。

犬细小病毒VP2基因测序分析李世静;嵇辛勤;主性;阮涌;傅心亮;王修江【摘要】为了解贵阳市犬细小病毒(CPV) VP2基因的遗传变异情况,从贵阳市黔灵动物医院采集经试剂盒检测为阳性的患犬粪便13份,对粪样进行病毒DNA的提取,并以此DNA为模板,进行PCR扩增,随机选取3株PCR阳性产物对其VP2基因进行序列测定与遗传变异分析.结果显示,抗原快速检测试剂盒与PCR检测结果符合率达76.9％；3个试验毒株之间VP2基因同源性达96.5％～97.3％,与参考毒株同源性为95.2％～96.8％；由遗传进化树可见,与国内分离毒株的亲缘性略高于国外分离株.结果表明,CPV抗原快速检测试剂盒与PCR法符合率较高,3个试验毒株与国内外流行毒株之间差异性不大.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)006【总页数】5页(P96-100)【关键词】犬细小病毒病;VP2基因;聚合酶链反应;序列分析【作者】李世静;嵇辛勤;主性;阮涌;傅心亮;王修江【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵阳市黔灵动物医院,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2犬细小病毒病（Canine parvovirus disease）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬的一种急性传染病，以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为特征，多发生于幼犬，病死率10%～50%［1］。

犬细小病毒最早是在1977年由美国学者Eugster和Nain从患出血性肠炎的病犬粪便中首次观察到的［2］，我国于1982年由徐汉坤等首次报道本病的流行。

到目前为止，犬细小病毒有CPV－2、CPV－2a、CPV－2b、CPV－2c（a）和CPV－2c（b）5个亚型［3］。